Name: improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tum

Forfatterne ønsker å takke dr. Lubor Borsig (Institute of Physiology, University of Zurich) om hans råd om teknikken av lunge perfusjon. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Krebsliga av Kanton Zürich, Walter L. og Johanna Wolf Foundation, Zürich, Lydia Hochstrasser Foundation, Zürich, den sveitsiske National Science Foundation, SNF, Sveits, Schweizerischer Verein Balgrist, og universitetet av Zürich.

1. In-situ Lung Perfusjon og Fiksering <ol><li> Anesthetize mus ved ip injeksjon av ~ 150 pl fosfatbufferet saltløsning (PBS) inneholdende 112,5 mg / kg (kroppsvekt) ketamin, 16,5 mg / kg xylazin, og 15 mg / kg acepromazin (eller av en annen anestesi inneholdende hensiktsmessige smertestillende). </li><li> Når reflekser av musen er ikke lenger observert, fikse det på operasjonsbordet tilbake ned og våt pels med 70% etanol til glatte hårene ned. </li><li> Åpne huden fra magen opp til halsen og trekk den til sidene eller fjerne den. </li><li> Åpne peritoneum og thorax til en god størrelse. Forhindre brudd store skip (f.eks vena jugularis) for å unngå redusert effektivitet av påfølgende perfusjon. </li><li> Skjær vena cava caudalis under leveren. </li><li> Bruk en 20 ml sprøyte utstyrt med en 21G - 24G nål til å injisere sakte 10-15 ml PBS inn i høyre ventrikkel det bankende hjertet til lungene er helt hvit oghjertet slutter å slå (asystole). </li><li> Knip fra blodkarene over leveren og membranen med en vaskulær klemme. </li><li> Bruke en 10 ml sprøyte utstyrt med en 21G - 24G nål til å injisere ~ 2 ml 3% paraformaldehyd (PFA) i PBS i den høyre ventrikkel. </li><li> Avdekke luftrøret utenfor thorax. Bruk samme sprøyten å injisere ~ 3 ml 3% PFA i PBS cranial (utenom thorax) inn i luftrøret til lungene er oppblåst. Umiddelbart etter fjerning av nålen, klemme av luftrøret caudale av punkteringen med en vaskulær klemme og vent i 10 minutter for å tillate fiksering. </li><li> Skjære over blodårer over vaskulær klemme, fjerne klemmen og injisere ~ 2 ml PBS inn i høyre ventrikkel for å fjerne overflødig PFA. </li><li> Punktering nedre deler av alle lungelapper med en nål, fjern vaskulær klemmen på luftrøret og injisere 3-5 ml av en oppløsning av PolyFreeze innebygging middels / PBS 01:01 i trachea caudale av første punktering inntil PFA i lungefliker er erstattet av løsningen. </li><li> Fjern lungene forsiktig ved å trekke hjertet med en pinsett og ved transecting bindevev leddbånd, blodårer og luftrøret. Holde hjertet koblet til lungene. </li><li> Avhengig av hvordan å gå videre med lungevevet analyse fortsette med protokollene fastsatt i del 2 eller 3. Hvis du ønsker å gjøre begge analysene, fjerne en lunge lapp og fortsett som beskrevet under 3. Behandle de gjenværende fliker koblet til hjertet som beskrevet under 2. </li></ol> 2. Visualisering av lacZ-merket metastatisk svulst celler i hele lungelapper <ol><li> Plasser lungen i en plastkopp med stram avsluttes lokk og feste den med 2% formaldehyd i PBS ved romtemperatur i 30-60 min. </li><li> Fjern fikseringsløsning og vask grundig 3 ganger med PBS. </li><li> Legge til minst 10 ml tilberedes 5-Bromo-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktosid (X-Gal) farging løsning (X-Gal stamoppløsning [40 mg / ml iDimetylformamid] 1:40 fortynnet i Basic Staining Løsning; pH 7,1 (tabell 1), beskytte mot lys). </li><li> Sette en bit gasbind oppå svømming lunge for å holde den helt i løsningen og plassere lokket bare løst på potten for å tillate utveksling av luft. </li><li> Inkuber ved 37 ° C i 3-5 timer beskyttet mot lys. </li><li> Fjerne X-Gal-løsning, skyll gang med PBS for å fjerne resterende X-Gal-løsning (valgfritt) og tilsett 4% PFA. </li></ol> 3. Visualisering av lacZ-merket metastatisk svulst celler i Lung Cryosections <ol><li> Forhåndsutfyll en merket embedding mold til 1/3 med ufortynnet PolyFreeze embedding medium. Sett lunge lobe på toppen og fylle opp med embedding medium til lapp er helt dekket. Prøv å unngå bobler. </li><li> Inkuber innebygde lungene ved 4 ° C i 20 min. </li><li> Deretter fryse de innleirede lungene langsomt i en blanding av tørris og isopentan og oppbevar ved -80 ° C. </li><li> Skjær 7-10 mikrometer cryodeler på en kryostaten og montere dem på SuperFrostPlus mikroskop lysbilder. </li><li> Inkuber deler umiddelbart med X-Gal farging løsning ved 37 ° C i 24 timer i en fuktet kammer. </li><li> Skyll lysbildene i PBS 2 ganger i 5 min og deretter raskt i destillert vann. </li><li> Counter-flekken med kjernefysisk rask rød for 10-30 sek, skyll i destillert vann og montere lysbildene med immunologiske-Mount. </li></ol> 4. Representant Resultater Asai et al. Rapportert i den opprinnelige artikkelen på Dunn-avledet LM8 OS mus modell som sc primære svulster avledet fra foreldrenes Dunn celler, forskjellig fra de som stammer fra den svært metastatisk LM8 sub cellelinje, ikke spontant danne påviselige lungemetastaser i syngeneic C3H mus 14. Med her rapporterte teknikker, reinvestigated vi dannelsen av metastaser i Dunn/LM8 mus OS modeller. Vi tok fordel av stabile lacZ-transduced Dunn og LM8 celles og av en protokoll for in-situ lunge perfusjon og fiksering i mus. Representative bilder av perfusert og ikke-perfusjon lunger av mus subkutant injisert med lacZ-transduced og ikke-transduced kontroll Dunn og LM8 celler er vist i figur 1. I mus injisert med kontroll Dunn celler, forble makroskopiske og mikroskopiske metastaser upåviselig i ikke-perfusert og perfusjon lungene (figur 1A, i-iv). Men interessant, i mus injisert med Dunn-lacZ-celler avslørte X-gal farging blå micrometastatic foci av enkeltceller eller småcellet klynger (&lt;0,1 mm) på overflaten av ikke-perfunderte lungene (figur 1A, VI). I situ perfusjon og fiksering av lungene ytterligere forbedret oppdagbarhet av Dunn-lacZ micrometastases (figur 1A, viii). Imidlertid ble utvekst til makroskopisk foci ikke observert (figur 1A, V, VII). &lt;/ P&gt; Hos mus injisert med kontroll LM8 celler, gjennomskinnelig, knapt synlig macrometastatic brennpunktene større enn 0,1 mm i diameter ble anerkjent i ikke-perfused lungene (figur 1B, i). Perfusjon av lungen (figur 1B, iii) ikke forbedre deteksjon av foci. Imidlertid, i mus injisert med LM8-lacZ-celler flere X-Gal blåfarget makro-(figur 1B, v) og micrometastases (figur 1B, vi) ble detektert på overflaten av ikke-perfunderte organer. Videre perfusjon av lungene ytterligere forbedret oppdagbarhet av makro-og micrometastases (figur 1B, VII - viii). Følgelig ble mikro-og macrometastases synlig på en høyere tetthet og et større antall, hovedsakelig på grunn av gjennomlysbarheten av perfusjon vev der foci under orgelet overflaten ble også synlig. En ekstra histological analyse ved hjelp cryosections av lungevev bekreftet den forbedrede oppdagbarhet av lungemetastaser i mus injisert med lacZ-transduced Dunn og LM8 celler. I mus med primære tumorer avledet fra Dunn-lacZ eller LM8-lacZ-celler, ble i motsetning til i mus med primære tumorer i de respektive kontrollceller, micrometastases eller selv enkelt celle brennpunktene anerkjent i lunge seksjoner (figur 2). Videre var macrometastases også mer klart synlig i mus injisert med LM8-lacZ-celler enn i dyr injisert med kontrollen LM8 celler (Figur 2C, D). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Figur 1. Påvisning av spontane metastaser av ikke-transduced (I-IV) og lacZ-transduced (v-viii) Dunn (A) og LM8 (B) celler i ikke-perfusjon (I, II, V, VI) og perfusjon (III, IV, VII, VIII) lungene i C3H mus. Metastaser i representative X-Gal-staSAKES hele lungene (v, vii i A og B) og respektive close-ups (VI, VIII i A og B) er blå. Macrometastatic foci (&gt; 0,1 mm) i de organer av mus injisert med ikke-kodede LM8 celler (i-iv i B) er merket med en stjerne. Områder vist i nærbilder er representative for hele lungene. Skala linjer indikerer 1 mm i bilder av hele lungene og 0,1 mm i close-ups. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Figur 2. Påvisning av Dunn og LM8 micrometastases i lunge cryosections. Deler av oktober innebygd lungevev ble inkubert i X-Gal farging løsning ved 37 ° C i 24 timer i en fuktet kammer og deretter kontrafarget med kjernefysisk rask rød. Pilene peker på micrometastatic foci anerkjent i lunge deler av mus injisert med Dunn-lacZ (B) eller LM8-lacZ celler (D). Micrometastases forble upåviselig i lungen deler av mus injisert med ikke-transduced Dunn (A) eller LM8 celler (C). Scale Linjene indikerer 0,1 mm.

<ol>
	<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature. 7, 645-658 (2007).</li><li>Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+inhibitors+and+cancer:+trials+and+tribulations.">Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations.</a> Science (New York, N.Y.). 295, 2387-2392 (2002).</li><li>Fass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+cancer:+a+review.">Imaging and cancer: a review.</a> Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).</li><li>Puaux, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+imaging+techniques+to+monitor+tumor+growth+and+cancer+progression+in+living+animals.">A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals.</a> Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538 (2011).</li><li>Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+polymerase+chain+reaction-based+method+for+detection+and+quantification+of+metastasis+in+human+xenograft+mouse+models.">A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).</li><li>Schmidt, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spontaneous+metastasis+in+an+aggressive+breast+carcinoma+model+using+flow+cytometry.">Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).</li><li>Horwitz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+for+Cytochemical+Demonstration+of+Enzyme+Activity.+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.">Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li><li>Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+lacZ+gene:+an+important+tool+for+metastasis+research+and+evaluation+of+new+cancer+therapies.">The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies.</a> Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).</li><li>Arlt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+gelatinase-specificity+of+matrix+metalloproteinase+inhibitors+correlates+with+antimetastatic+efficacy+in+a+T-cell+lymphoma+model.">Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model.</a> Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+inhibition+of+intra-peritoneal+tumor+growth+and+dissemination+of+human+ovarian+carcinoma+cells+in+nude+mice+by+anti-L1-cell+adhesion+molecule+monoclonal+antibody+treatment.">Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment.</a> Cancer research. 66, 936-943 (2006).</li><li>Banke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+inhibition+of+experimental+metastasis+and+prolongation+of+survival+in+mice+by+a+potent+factor+Xa-specific+synthetic+serine+protease+inhibitor+with+weak+anticoagulant+activity.">Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity.</a> Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).</li><li>Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+and+cancer+revisited:+mechanistic+connections+involving+platelets,+P-selectin,+carcinoma+mucins,+and+tumor+metastasis.">Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LacZ+transgene+expression+in+the+subcutaneous+Dunn/LM8+osteosarcoma+mouse+model+allows+for+the+identification+of+micrometastasis.">LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis.</a> J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).</li><li>Asai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+murine+osteosarcoma+cell+line+(LM8)+with+high+metastatic+potential+to+the+lung.">Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung.</a> International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antineoplastic+antibiotic+taurolidine+promotes+lung+and+liver+metastasis+in+two+syngeneic+osteosarcoma+mouse+models+and+exhibits+severe+liver+toxicity.">The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity.</a> International journal of cancer. , (2011).</li><li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma.">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

De her presenteres resultater i Dunn/LM8 mus OS modell demonstrere makt den nyopprettede metode som kombinerer X-Gal farging av lacZ-merket tumorceller med in-situ perfusjon / fiksering av lungevev. Denne kombinasjonen av de to teknikkene gir høy følsomhet påvisning av micrometastatic lesjoner ned til enkelt celle nivå og også forbedrer visualiseringen av macrometastases på lunge overflaten (figur 1), så vel som i lunge seksjoner (figur 2). Mens X-Gal farging tillater også påvisning av (mikro) metastaser i andre organer, in-situ perfusjon / fiksering forbedrer oppdagbarhet av metastatisk foci i vev enn lungen bare litt på grunn av den naturlig blod-og vev-relaterte farge av disse organene 13. Selv om perfusjon er rettet mot et annet organ, f.eks leveren, ville fjernelse av blodet bare delvis forbedre kontrasten innsatsenWeen X-Gal flekker og den naturlige fargen på orgel. Imidlertid er metoden anvendelig for alle typer lacZ-merkede tumorceller, vil dramatisk forbedre oppdagbarhet av lunge metastasering ned til nivået av sovende encellede micrometastases og muliggjør en enkel og pålitelig kvantifisering av makro-og micrometastases. En begrensning av denne metoden, og alle andre teknikker som er basert på rapportørgrupper gener, inkludert luciferase og fluorescerende proteiner, er stabiliteten av transgenet uttrykket. Som vist i figur 2d, er ikke alle tumorceller innenfor macrometastatic foci blåfarget, som indikerer fravær av beta-galaktosidase-aktivitet. Dette kan være relatert til nekrose, men det er mer sannsynlig på grunn av tap av transgene uttrykk. Vi observerte at Dunn og LM8 celler er svært effektive i nedregulering av lacZ og andre transgener selv under kontinuerlig utvalg for uttrykk. Vi har derfor slått i nyere studier til murine K12og K7M2 og de ​​menneskelige HOS, 143b og SaOS-2 osteosarkom cellelinjer, som alle opprettholdes stabil lacZ ekspresjon in vitro, så vel som in vivo opp til 100% over tid. Når stabil lacZ-uttrykk er garantert, kan denne teknikken brukes i studier med gen-manipulerte tumorceller, f.eks til mekanistisk undersøke prosessen med vev kolonisering 13, samt for utvikling og testing av nye behandlingsformer med sikte på utryddelse av metastatisk lesjoner 15 , 16 år. Videre kan det tjene som en målestokk for forbedring av dagens radiologiske imaging teknikker, for eksempel PET, (micro) CT og MR, som brukes for tidlig deteksjon av metastatisk lesjoner. I en nylig undersøkelse PET (upublisert) med forskjellige tracere verifisert vi in vivo detektert lungemetastaser senere ex vivo med den beskrevne protokoll. I en pågående studie med en ny liten dyr mikro-CT (SkyScan) vi er så langt able for å oppdage lungemetastaser i vivo ned til en størrelse på 0,5 mm og ex vivo ned til 0,3 mm, men vi sikte på en oppløsning på 0,1 mm. Interessant nok er denne størrelsen grensen som vi satt å skille makro-fra micrometastases med den kombinerte metode in-situ perfusjon og X-Gal farging. Dette understreker igjen følsomheten og nytten av denne enkle og kostnadseffektive teknikk.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Narketan10 (ketamin) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml oppløsning </td></tr><tr><td> Xylazin (xylazin) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml oppløsning </td></tr><tr><td> Prequilan (acepromazine) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml oppløsning </td></tr><tr><td> Bulldog type Serrefine vaskulær klemme </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 18051-35 </td><td> buet, 35 mm </td></tr><tr><td> Plastbeger med lokk </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 ml kopper med lokk </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktosid (X-Gal); pulver </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> oppløses i N, N-Di-metylformamid til 40 mg / ml, lagre lys-beskyttet ved -20 ° C </td></tr><tr><td> Grunnleggende farging løsning, ekvilibrert til pH 7,1, lagret lys-beskyttet ved 4 ° C i maks. 1 måned </td><td> selvlagde </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L MgC&#39;2 1M, 2 ml / L 10% NP40, 1 ml / l 10% Natrium-deoksycholat </td></tr><tr><td> PolyFreeze Embedding Medium </td><td> Polysciences, swiss distributør: Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Innebygging mold </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 cryostat </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost lysbilder </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Kjernefysisk Fast Red - Aluminum sulfate løsning </td><td> Divisjon Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immunologiske-Mount </td><td> Thermo Electron, swiss distributør: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Reagenser og utstyr.

improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells

Metastasering er den viktigste dødsårsaken i de fleste krefttyper og dermed et hovedfokus i kreftforskning. Imidlertid, påvisning av micrometastases etter radiologiske bildebehandling og suksessen i deres terapeutiske utrydding forblir begrenset. Mens dyremodeller har vist seg å være uvurderlig verktøy for kreftforskning 1, forblir overvåking / visualisering av micrometastases en utfordring og unøyaktig vurdering av metastatisk spredning i prekliniske studier potensielt fører til skuffende resultater i kliniske studier 2. Følgelig er det stor interesse i raffinering metodene å endelig tillate reproduserbare og pålitelig deteksjon av metastaser ned til enkelt celle nivå i normalt vev. Hovedfokus er derfor på teknikker, som tillater påvisning av kreftceller in vivo, som mikro-CT (micro-CT), positronemisjonstomografi (PET), Bioluminescens eller fluorescens bildebehandling &lt;sup&gt; 3,4. Vi er for tiden å optimalisere disse teknikkene for in vivo overvåking av primærtumor vekst og metastasering i ulike osteosarkom modeller. Noen av disse teknikkene kan også brukes for ex vivo analyse av metastasering ved klassiske metoder som 5 qPCR, FACS 6 eller ulike typer histologisk farging. Som en målestokk, har vi etablert i den foreliggende studie var stabile transfeksjon eller transduksjon av tumorceller med lacZ-genet som koder for bakteriell enzymet β-galaktosidase som metabolizes det kromogene substrat 5-brom-4-klor-3-indolyl-beta-D -galaktopyranosid (X-Gal) til en uløselig indigo blå fargestoff 7 og tillater svært følsom og selektiv histochemical blå farging av tumorceller i mus vev ex vivo ned til enkelt celle nivå som vist her. Dette er en lav-kost og ikke utstyr-intensive verktøyet, som lar presis validering av metastaser 8 i studier vurdere nye enticancer terapi 9-11. En begrensende faktor på X-gal farging er lav kontrast til f.eks blodrelaterte røde farging av brønn vaskularisert vev. I lungevev dette problemet kan løses ved in-situ lunge perfusjon, en teknikk som nylig ble etablert av Borsig et al. 12 som perfused lungene av mus under narkose for å fjerne dem fra blod og å fikse og legge dem in-situ i henhold inflasjonen gjennom luftrøret. Denne metoden forhindrer også sammenbruddet av lungen og derved opprettholder morfologien av funksjonelle lunge alveoler, som forbedrer kvaliteten av vevet for histologisk analyse. I foreliggende studie, beskriver vi en ny protokoll, som utnytter en kombinasjon av X-gal farging av lacZ-uttrykkende tumorceller og in-situ perfusjon og fiksering av lungevev. Denne raffinerte protokollen gir høy følsomhet deteksjon av enkle metastatisk celler i lungene og aktivert oss i en fersk undersøkelse for å detect &quot;hvilende&quot; lunge micrometastases i en mus modell 13, som opprinnelig ble beskrevet å være ikke-metastatisk 14.

Watch this Scientific Journal Video about Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tum

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Romanen protokollen rapportert i denne studien kan selektiv påvisning av lungemetastaser ved enkelt celle oppløsning i mus ved kombinerte<em&gt; In-situ</em&gt; Lunge perfusjon og fiksering og X-Gal farging av<em&gt; LacZ</em&gt;-Merket tumorceller.

Forbedret Visualisering av lungemetastaser ved Single Cell Oppløsning i Mus med Kombinert<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusjon av lungevev og X-Gal Farging av<em&gt; LacZ</em&gt;-Merket tumorceller

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Måte Isolert<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Lung Perfusjons i en Rat Modell: Erfaringer fra å utvikle en Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Primær Tumor og MEF Cell Isolation å studere Lung Metastase

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect

Hjertekateterisering i Mus for å måle trykket Volume Forholdet: Gransker Bowditch Effect

Animal models that mimic human cardiac disorders have been created to test potential therapeutic strategies. A key component to evaluating these ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Evaluering av Lung metastaser i Mouse Brysttumormodeller av kvantitativ real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Åpne trakeostomi magesyre aspire Murine modell av akutt lungeskade Resultater i Maximal Akutt-dødelige lungeskade

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Adeno-assosiert Virus-mediert levering av CRISPR for Cardiac genet redigering i mus

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Generasjon av menneskelig 3D lungevev kulturer (3D-LTCs) for sykdom modellering

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Kvantitativ analyse av mobilnettet komposisjon i avansert aterosklerotisk lesjoner av glatt muskel celle avstamning-Tracing mus

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Inducing akutt lungeskade i mus ved direkte Intratrakeal lipopolysakkarid drypping

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Vurdering av akutt innånding av luftbårne partikler ved å utsette dyrkede menneskelige lungeceller ved luftflytende grensesnitt

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...