Name: improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tum

Yazarlar akciğer perfüzyon tekniği onun tavsiye için Dr Lubor Borsig (Fizyoloji Enstitüsü, Zürih Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Kanton Zürih Krebsliga, Walter L. ve Johanna Kurt Vakfı, Zürih, Lydia Hochstrasser Vakfı, Zürih, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı, SNF, İsviçre, Schweizerischer Verein Balgrist ve Üniversitesi bağışları ile desteklenmiştir Zürih.

1. In-situ Akciğer Perfüzyon ve Fiksasyon <ol><li> ~ 150 ul fosfat IP enjeksiyonu ile farelerin anestetize salin (PBS) ile 112.5 mg / kg (vücut ağırlığı) ketamin, 16.5 mg / kg ksilazin, ve 15 mg / kg &#39;ye asepromazin (veya uygun bir ağrı kesici içeren başka bir anestezi ile). Içeren tamponlu </li><li> Fare refleksleri artık gözlenen olduğunda, geri aşağı ameliyat masasında düzeltmek ve aşağı kaygan kıllar% 70 Etanol ile kürk ıslak. </li><li> Boynuna karın cilt kadar açın ve yanlara çekin veya kaldırın. </li><li> Geniş bir boyuta periton ve toraks açın. Sonraki perfüzyon azalmış etkinlik kaçınmak için büyük gemilerin rüptürü (örn. vena jugularis) önleyin. </li><li> Karaciğer altında vena kava caudalis kesin. </li><li> Akciğer tamamen beyaz ve kadar dayak kalbin sağ ventrikül içine yavaşça 10-15 ml PBS enjekte 24G iğne - 21G ile donatılmış 20 ml şırınga kullanınkalp (asistoli) yenerek durur. </li><li> Vasküler klemp ile karaciğer ve diyafram yukarısında kan damarlarından sıkıştırın. </li><li> Sağ ventrikül içine PBS içinde% 3 paraformaldehid ~ 2 ml (PFA) enjekte 24G iğne - 21G ile donatılmış 10 ml şırınga kullanın. </li><li> Toraks dışında trakea ortaya çıkarın. Akciğer şişirilmiş kadar trakea içine PBS kranyal (toraks dışında) 3% PFA ~ 3 ml enjekte aynı şırınga kullanın. Hemen iğne çıkarıldıktan sonra, vasküler klemp ile ponksiyon trakea kaudal çimdiklemek ve fiksasyonu sağlamak için 10 dakika bekleyin. </li><li> Vasküler klemp üzerinde kan damarları transeksiyonu, kelepçe kaldırmak ve aşırı PFA kaldırmak için sağ ventriküle ~ 2 ml PBS enjekte. </li><li> Delinme bir iğne ile tüm akciğer lobu alt kısımları, trakea vasküler klemp kaldırmak ve de PFA kadar ilk ponksiyon trakea kaudal içine orta / PBS 01:01 gömme PolyFreeze bir çözüm 3-5 ml enjekte akciğerloblar çözümü ile değiştirilir. </li><li> Bir forseps ile kalp çekerek ve bağ dokusu bağ, kan damarları ve trakea transecting tarafından dikkatle akciğer çıkarın. Akciğere bağlı kalp tutun. </li><li> Akciğer doku analizi ile devam etmek nasıl bağlı bölümlerde 2 veya 3&#39;te protokolleri ile devam edin. Her iki analiz yapmak istiyorsanız, bir akciğer lobunun kaldırmak ve 3 altında açıklandığı gibi devam edin. 2 altında tarif edildiği gibi kalp bağlı kalan loblar işlemden geçirin. </li></ol> 2. Tüm Akciğer lobları içinde lacZ etiketli Metastatik Tümör Hücrelerinin Görselleştirme <ol><li> Sıkı bir kapatma kapağının ile plastik bir kap içinde akciğer yerleştirin ve 30-60 dakika için oda sıcaklığında PBS içinde% 2 formaldehit ile sabitleyin. </li><li> Fiksasyon çözüm çıkarın ve PBS ile iyice 3 kez yıkayın. </li><li> Taze 5-Bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozid (X-Gal) boyama çözeltisi (X-Gal stok çözeltisi [40 mg / ml &#39;de hazırlanmış en az 10 mLDimetilformamid] 01:40 Temel Boyama Çözüm seyreltilerek, pH 7.1 (Tablo 1); ışıktan korumak). </li><li> Çözelti içinde tamamen tutmak ve hava değişimini sağlamak için kap üzerinde sadece gevşek kapak yerleştirmek için yüzme akciğer üstünde bir gazlı bezi koyun. </li><li> Işıktan korunmuş 3-5 saat süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> X-Gal çözüm çıkarın, rezidüel X-Gal çözümü (isteğe bağlı) çıkarın ve% 4 PFA eklemek için bir kez PBS ile yıkayın. </li></ol> 3. Akciğer Cryosections yılında lacZ etiketli Metastatik Tümör Hücrelerinin Görselleştirme <ol><li> Seyreltilmemiş PolyFreeze gömme orta 1/3 önceden doldur etiketli gömme kalıp. Üst lobun koyun ve lob tamamen kaplıdır kadar orta gömme ile doldurmak. Kabarcıkları önlemek için deneyin. </li><li> 20 dk için 4 ° C sıcaklıkta gömülü akciğer inkübe edin. </li><li> Daha sonra -80 ° C de yavaş yavaş kuru buz ve izopentan ve depo karışımı içinde gömülü akciğer donma </li><li> 7-10 mikron kriyo CutKriyostaz bölümleri ve SuperFrostPlus mikroskop slaytlar takar. </li><li> Nemlendirilmiş bir oda içinde 24 saat için 37 ° C de X-Gal boyama solüsyonu ile hemen bölümleri inkübe edin. </li><li> Distile su içinde kısa bir süre sonra 5 dk PBS 2 kez slaytları durulayın. </li><li> , 10-30 sn nükleer hızlı kırmızı ile Counter-leke distile su ile durulayın ve İmmünoreaktif-Dağı ile slaytlar monte. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Asai ark. Yüksek metastatik LM8 alt hücre hattı elde edilenler farklı ebeveyn Dunn hücrelerinden türetildiği sc primer tümörleri, kendiliğinden saptanabilir akciğer metastazları kurmazlar ki Dunn-türetilmiş LM8 OS fare modeli üzerinde özgün makale bildirilmiştir singenik C3H farelerin 14. Burada bildirilen teknikleri ile, Dunn/LM8 fare OS modellerinde metastaz oluşumu yeniden incelenmiştir. Biz istikrarlı lacZ-transduced Dunn ve LM8 hücre yararlandıs ve farelerde in-situ akciğer perfüzyon ve fiksasyon için bir protokol. Deri altından enjekte edilmiş farelerin perfüze ve non-perfüze akciğer Örnek görüntüleri lacZ-transdük ve kontrol Dunn ve LM8 hücre Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir olmayan transdük. Kontrolü Dunn hücreleri enjekte farelerde, makroskopik ve mikroskopik metastaz olmayan perfüze ve perfüze akciğer (Şekil 1A, i-iv) algılanamayan kalmıştır. Ancak ilginç bir şekilde, Dunn-lacZ hücreleri ile enjekte edilen farelerde, X-gal boyaması olmayan akciğer perfüze (Şekil 1A, vi) yüzeyi üzerinde tek bir hücre ya da hücre kümeleri küçük (&lt;0.1 mm) mavi mikrometastazların odak görüldü. Içinde, Akciğerlerin situ perfüzyon ve fiksasyon daha Dunn-lacZ mikrometastaz (Şekil 1A, viii) ve görülebilirliği artırıldı. Ancak, makroskopik odakları için akıbet (Şekil 1A, v, vii) gözlenmemiştir. &lt;/ P&gt; Saydam kumanda LM8 hücreleri, zor tespit macrometastatic odakları ile enjekte farelerde çapı 0.1 mm&#39;den büyük olmayan perfüze akciğer (Şekil 1B, i) kabul edildi. Akciğer Perfüzyon (Şekil 1B, iii) odaklarının tespiti düzelmedi. Bununla birlikte, farelerde çoklu LM8-lacZ hücreleri ile enjekte X-Gal mavi lekeli makro-(Şekil 1B, D) ve mikrometastazların (Şekil 1B, vi) non-perfüze organ yüzeyine tespit edilmiştir. Ayrıca, akciğer perfüzyon daha tanımlanabilirliğini makro ve mikro metastaz (- viii Şekil 1B, vii) düzeldi. Sonuç olarak, mikro-macrometastases ve esas olarak, organ yüzeyin altında odaklar görünür hale geldiği perfüze doku geçirgenliği için, daha yüksek yoğunluk ve daha büyük bir sayıda görünür hale gelmiştir. İlave bir saatAkciğer dokusunda cryosections kullanarak istological analizi lacZ-transduced Dunn ve LM8 hücreler enjekte edilmiş farelere akciğer metastazı gelişmiş tanımlanabilirliğini doğruladı. Dunn-lacZ veya LM8-lacZ hücrelerinden türetildiği primer tümörlü farelerde, ilgili kontrol hücreleri, mikrometastaz hatta tek hücre odakları primer tümörleri olan farelerin aksine akciğer bölümler (Şekil 2) kabul edildi. Ayrıca, macrometastases da kontrol LM8 hücreleri (Şekil 2C ve D) ile enjekte edilen hayvanlarda daha LM8-lacZ hücreleri ile enjekte edilen farelerde daha açık bir şekilde görünür olmuştur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Şekil 1., Spontan metastazlarının tespiti olmayan, transdüksiyon, (i-iv) ve lacZ-transdüksiyon ile (V-VIII) Dunn (A) ve LM8 (B) non-perfüze (I, II, V, VI) ile perfüze hücreleri C3H farelerde (iii, iv, vii, viii) akciğerler. Temsili X-Gal-sta Metastazlariined bütün akciğerler (v, A ve B vii) ve ilgili yakın çekimler (vi, viii A ve B) mavi görünür. Etiketli olmayan LM8 hücreleri (B i-iv) ile enjekte edilen farelerin organlarında Macrometastatic odak (&gt; 0,1 mm) yıldız işareti ile gösterilir. Yakın çekimler gösterildiği Alanları genelinde akciğerler için temsilidir. Ölçek çubukları tüm akciğer görüntüleri 1 mm ve yakın-up 0,1 mm göstermektedir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Şekil 2. Dunn ve akciğer cryosections içinde LM8 mikrometastaz saptanması. Ekim gömülü akciğer doku kesitlerinde nemlendirilmiş bir oda içinde 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de X-gal boyaması çözelti içinde inkübe edildi ve daha sonra nükleer hızlı kırmızı ile zıt edildi. Oklar Dunn-lacZ (B) veya LM8-lacZ hücreleri (D) ile enjekte farelerin akciğer bölümlerinde tanınan mikrometastatik odakları işaret. Micrometastases olmayan transdük Dunn (A) ya da LM8 hücreleri (C) ile enjekte edilen farelerde akciğer bölümlerinde saptanamaz kalmıştır. Ölçek çubukları 0.1 mm göstermektedir.

<ol>
	<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature. 7, 645-658 (2007).</li><li>Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+inhibitors+and+cancer:+trials+and+tribulations.">Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations.</a> Science (New York, N.Y.). 295, 2387-2392 (2002).</li><li>Fass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+cancer:+a+review.">Imaging and cancer: a review.</a> Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).</li><li>Puaux, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+imaging+techniques+to+monitor+tumor+growth+and+cancer+progression+in+living+animals.">A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals.</a> Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538 (2011).</li><li>Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+polymerase+chain+reaction-based+method+for+detection+and+quantification+of+metastasis+in+human+xenograft+mouse+models.">A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).</li><li>Schmidt, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spontaneous+metastasis+in+an+aggressive+breast+carcinoma+model+using+flow+cytometry.">Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).</li><li>Horwitz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+for+Cytochemical+Demonstration+of+Enzyme+Activity.+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.">Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li><li>Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+lacZ+gene:+an+important+tool+for+metastasis+research+and+evaluation+of+new+cancer+therapies.">The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies.</a> Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).</li><li>Arlt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+gelatinase-specificity+of+matrix+metalloproteinase+inhibitors+correlates+with+antimetastatic+efficacy+in+a+T-cell+lymphoma+model.">Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model.</a> Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+inhibition+of+intra-peritoneal+tumor+growth+and+dissemination+of+human+ovarian+carcinoma+cells+in+nude+mice+by+anti-L1-cell+adhesion+molecule+monoclonal+antibody+treatment.">Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment.</a> Cancer research. 66, 936-943 (2006).</li><li>Banke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+inhibition+of+experimental+metastasis+and+prolongation+of+survival+in+mice+by+a+potent+factor+Xa-specific+synthetic+serine+protease+inhibitor+with+weak+anticoagulant+activity.">Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity.</a> Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).</li><li>Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+and+cancer+revisited:+mechanistic+connections+involving+platelets,+P-selectin,+carcinoma+mucins,+and+tumor+metastasis.">Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LacZ+transgene+expression+in+the+subcutaneous+Dunn/LM8+osteosarcoma+mouse+model+allows+for+the+identification+of+micrometastasis.">LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis.</a> J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).</li><li>Asai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+murine+osteosarcoma+cell+line+(LM8)+with+high+metastatic+potential+to+the+lung.">Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung.</a> International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antineoplastic+antibiotic+taurolidine+promotes+lung+and+liver+metastasis+in+two+syngeneic+osteosarcoma+mouse+models+and+exhibits+severe+liver+toxicity.">The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity.</a> International journal of cancer. , (2011).</li><li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma.">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Dunn/LM8 fare modelinde OS burada sunulan sonuçlar, in-situ perfüzyon / akciğer dokusunda tespit lacZ ile etiketlenmiş tümör hücreleri X-gal boyaması birleştiren yeni kurulan yöntem gücünü göstermektedir. İki tekniğin bu kombinasyonu tek bir hücre düzeyinde mikrometastazların lezyonların yüksek duyarlılık tespit aşağı izin verir ve aynı zamanda akciğer yüzey (Şekil 1) hem de akciğer bölümler halinde (Şekil 2) üzerindeki macrometastases bir görüntüleme artırır. X-Gal boyama da çünkü doğal kan ve doku ile ilgili renk diğer organları, in-situ perfüzyon / fiksasyonu (mikro) metastaz tespiti sadece biraz akciğer dışındaki dokularda metastatik odaklar tanımlanabilirliğini geliştirir sağlarken Bu organların 13. Başka bir organ perfüzyon yönlendirilir bile, karaciğer, örneğin, kan kaldırılması sadece kısmen kontrast bahsi artıracakween X-Gal boyama ve organ doğal rengi. Bununla birlikte, yöntem lacZ-etiketli tümör hücrelerinin her türü için geçerli olduğu, önemli ölçüde hareketsiz tek hücreli mikrometastazların seviyesine akciğer metastazı tanımlanabilirliğini arttırmak aşağı ve makro ve mikrometastazların bir miktarı kolay ve güvenilir bir miktar sağlar olacaktır. Bu yöntem ve lusiferaz ve floresan proteinleri içeren muhabiri genleri, dayalı tüm diğer tekniklerin bir sınırlama transgen ifade istikrardır. Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, macrometastatic odakları içindeki tüm tümör hücreleri beta-galaktosidaz aktivitesi eksikliği gösteren mavi lekeli. Bu nekroz ile ilgili olabilir, ama daha büyük olasılıkla transgen ekspresyonu kaybı nedeniyle. Biz Dunn ve LM8 hücreleri ifade için bile sürekli seçilim altında lacZ ve diğer transgenlerin down-regülasyonu çok etkili olduğu görülmektedir. Bu nedenle fare K12 için son yıllarda yapılan çalışmalarda açıkve K7M2 ve bütün in vitro hem de yukarı saat boyunca% 100 in vivo kararlı lacZ ekspresyonu yapılmaktadır HOS insan, 143b ve Saos-2 osteosarkoma hücre hattı. LacZ ifade kez kararlı garantilidir, bu tekniğin mekanistik doku kolonizasyonu 13 gibi metastatik lezyonlar 15 eradikasyonu hedefleyen yeni tedavilerin geliştirilmesi ve test sürecini araştırmak için örneğin gen-manipüle tümör hücreleri ile çalışmalarda uygulanabilir , 16. Ayrıca, metastatik lezyonların erken tanısında kullanılan PET, (mikro) BT ve MRG gibi güncel radyolojik görüntüleme teknikleri, iyileştirilmesi için bir kriter olarak hizmet verebilir. Farklı izleyiciler ile yeni PET çalışmasında (yayımlanmamış) biz in vivo tespit akciğer açıklanan protokol ile sonradan ex vivo metastazları doğrulanmadı. Yeni bir küçük hayvan mikro-BT ile devam eden bir çalışmada (SkyScan) biz bugüne kadar ab vardırle 0,5 mm ve ex vivo aşağı 0,3 mm bir boyuta in vivo akciğer metastazları aşağı algılamak için, ama biz 0.1 mm çözünürlükte hedefliyoruz. İlginçtir, bu biz in-situ perfüzyon ve X-Gal boyama kombine yöntemi ile mikrometastaz makro-ayırt etmek ayarladığınız boyut sınırıdır. Bu da yine bu kolay ve maliyet-etkili bir tekniğin duyarlılık ve kullanışlılığı altını çiziyor.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Narketan10 (ketamin) </td><td> Vetoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml solüsyon </td></tr><tr><td> Xylazin (xylazine) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml çözelti </td></tr><tr><td> Prequilan (Acepromazine) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml çözelti </td></tr><tr><td> Bulldog Tipi vasküler klemp Serrefine </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 18051-35 </td><td> kavisli, 35 mm </td></tr><tr><td> Kapaklı plastik bardak </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> Kapaklı 25 ml bardak </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozid (X-Gal); toz </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> depo, N-Di-methylformamide 40 mg / ml &#39;ye, N-korumalı çözülür ışık -20 ° C&#39; de </td></tr><tr><td> Maksimum ışık-korumalı 4 ° C&#39;de saklanır pH 7.1 &#39;e kadar dengelenmiş temel boyama çözeltisi,,. 1 ay </td><td> kendi kendini yetiştirmiş </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1.64 g / L K3Fe (CN) 6, 2.1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 mL / L 1 M MgCl2, 2 ml / L, 10% NP40, 1 ml / L, 10% sodyum-deoksikolatın </td></tr><tr><td> PolyFreeze Katıştırma Orta </td><td> Polysciences; swiss distribütörü: Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Kalıp Katıştırma </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 kriyostat </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost slaytlar </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nükleer-Hızlı Kırmızı - Alüminyum sülfat çözeltisi </td><td> Lig Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> İmmünoreaktif Montaj </td><td> Thermo Electron, swiss distribütörü: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Reaktifler ve Ekipmanları.

improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells

Metastaz kanser türlerinin çoğunda başlıca ölüm nedeni ve kanser araştırma, dolayısıyla bir ana odak noktasıdır. Ancak, radyolojik görüntüleme ve tedavi eradikasyon başarısı ile mikrometastaz tespit sınırlı kalır. Hayvan modellerinde kanser araştırma 1 için çok değerli araçlar olduğu kanıtlanmış olsa da, izleme / mikrometastazlar görselleştirme preklinik çalışmalarda bir meydan okuma ve metastatik yayılım eksik değerlendirilmesi potansiyel klinik çalışmalarda 2 hayal kırıklığı yaratan sonuçlar yol açar kalır. Sonuç olarak, nihayet normal dokuda tek hücre düzeyinde metastaz tekrarlanabilir ve güvenilir algılama sağlamak için metodlarla rafine büyük ilgi var. Ana odak nedenle mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT), pozitron emisyon tomografisi (PET), biyolüminesans veya floresan görüntüleme gibi in vivo tümör hücrelerinin algılanmasına izin teknikleri üzerinde &lt;&gt; 3,4 sup. Biz şu anda farklı osteosarkom modelleri primer tümör büyümesi ve metastaz vivo izlenmesi için bu teknikleri optimize edilmiştir. Bu tekniklerin bazıları qPCR 5, 6 ya da FACS histolojik boyama farklı türleri gibi klasik yöntemlerin yanında metastaz ex vivo analiz için de kullanılabilir. Bir kriter olarak, kararlı transfeksiyon veya lacZ geni ile tümör hücrelerinin transdüksiyonu bakteriyel bir enzim kromojenik substrat 5-bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D metabolize β-galaktosidaz kodlayan bu çalışmada kurduk çözülmeyen bir indigo mavisi 7 ve burada gösterildiği gibi tek hücre düzeyinde fare doku ex vivo olarak tümör hücrelerinin son derece hassas ve seçici histokimyasal mavisi boyama aşağı izin verir-galactopyranoside (X-Gal). Bu çalışmalarda metastaz 8 hassas doğrulama bir yeni değerlendirmede olanak sağlayan düşük maliyetli ve ekipman yoğun değil araçtırticancer tedaviler 9-11. X-gal boyası bir sınırlayıcı faktör de vaskülarize dokuların kan ile ilgili kırmızı boyama, örneğin düşük kontrast olduğunu. Akciğer dokusunda bu sorunu yerinde akciğer perfüzyon, son zamanlarda Borsig ark. 12. Kan bunları temizlemek için ve altında in-situ bunları düzeltmek ve gömmek için anestezi altında farelerin akciğerlerinde perfüze tarafından kurulmuş bir teknik ile çözülebilir trakea yoluyla enflasyon. Bu yöntem aynı zamanda akciğer çökmesi önler ve böylece histolojik analiz için doku kalitesini geliştirmektedir fonksiyonel akciğer alveol, morfolojisini muhafaza eder. Bu çalışmada, biz lacZ eksprese tümör hücrelerinin X-gal boyası bir arada yararlanır ve in-situ perfüzyon ve akciğer doku fiksasyonu., Yeni bir protokol, tarif Bu rafine protokol akciğerde tek metastatik hücrelerinin yüksek hassasiyet algılama sağlar ve d yeni bir çalışmada bize etkinBaşlangıçta 14 sigara metastatik olduğu açıklanan bir fare modeli 13 yılında &quot;atıl&quot; akciğer mikrometastazlar etect.

Watch this Scientific Journal Video about Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tum

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Bu çalışmada bildirilen yeni protokol kombine farelerde tek hücreli çözünürlükte metastaz seçici algılama sağlar<em&gt; In-situ</em&gt; Akciğer perfüzyon ve fiksasyon ve X-Gal boyama<em&gt; LacZ</emTümör hücreleri&gt; etiketli.

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

İzole Yöntemi<em&gt; Ex vivo</emBir Rat Modelinde&gt; Akciğer Perfüzyon: Sıçan EVLP Programı Geliştirme Öğrenilmiş Dersler

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect

Bowditch Efekt incelenmesi: Basınç Hacim İlişkisi Tedbir Fare Kardiyak Kateterizasyon

Animal models that mimic human cardiac disorders have been created to test potential therapeutic strategies. A key component to evaluating these ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Akut Akciğer Hasarı Açık Trakeostomi Gastrik Asit Aspirasyon Fare Modeli Maksimal Akut Ölümcül olmayan Akciğer Hasarı Sonuçlar

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Hastalık modelleme için insan 3D akciğer doku kültürleri (3D-LTCs) nesil

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Kantitatif analiz düz kas hücre soy izleme farelerin gelişmiş aterosklerotik lezyonları içinde hücresel kompozisyon

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Doğrudan Intratracheal Lipopolysaccharide Instilasyon ile farelerde akut akciğer hasarının İndükleme

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Hava-Sıvı Arabiriminde Ekili İnsan Akciğer Hücrelerinin Açığa Çıkarılması yla Havadaki Partiküllerin Akut İnhalasyon Toksisitesinin Değerlendirilmesi

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...