Name: visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation
Uploaded: 2012-07-26T13:00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות ד&quot;ר קתלין מאת&#39;רס, ד&quot;ר ז&#39;אן פיליפ מוצ&#39;ו וד&quot;ר יולנדה סאבדרה טורס על עזרתם להופיע electroporation ברחם תחת נהלים אספטיים ועץ היילי על עזרתה להכין את הציורים. EP נתמך על ידי הפדרציה ארוך טווח של חברות אירופיות ביוכימיות (FEBS) המילגה ואת המועצה למחקר רפואי (MRC) פיתוח קריירה המילגה, MAH ידי קרן Wellcome מענק אליזבת פישר ויקטור Tybulewicz (080174/B/06/Z) , HW ידי לטווח ארוך EMBO המילגה ו RA ידי studentship MRC. עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרויקט של קרן Wellcome (086947/Z/08/Z) ועל ידי מענק-in-Aid מן המועצה למחקר רפואי (U117570528) כדי FG

בבריטניה, עכברים הם שוכנו, התרבו, וטופלו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי משרד הפנים תחת בעלי חיים (הליכים מדעיים) משנת 1986. 1. אופן ההכנה: פתרון ה-DNA ואת מחטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הדנ&quot;א פלסמיד עם ערכת רעלן פנימי חינם Maxi-Prep. הכן את פתרון ה-DNA פלסמיד להזרקה לריכוזים הרצויים במים ולהוסיף גרין מהירה (הריכוז הסופי של 0.05%) לדמיין זריקות. היעילות של electroporation תלויה מאוד ריכוז ה-DNA. ריכוז של 1 מיקרוגרם / μl משמש בדרך כלל. ריכוז זה מספיק לדמיין נוירונים electroporated מבלי להשפיע על התפתחותם. עם זאת, על פי מקדם משמש וקטור פלסמיד (רמת ביטוי נמוכה עם האמרגן ציטומגלווירוס / משפר, רמת ביטוי חזק עם ציטומגלווירוס מיידית משפר מוקדם עוף β-אקטין היתוך האמרגן (החטיבה) האמרגן), כמו גם את הגודל<html> היציבות של החלבון לידי ביטוי, ריכוז זה יכול להיות מותאם (0.25 מיקרוגרם / μl עד 5 מיקרוגרם / μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך מחטים זכוכית באמצעות חולץ micropipette. </li></ol> 2. הכנת הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי מכשירי ניתוח וכן מאגר מלוחים פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון כאבים ב PBS (עצירות, ריכוז Vetergesic, האחרון של 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל). לשקול את העכבר בהריון להזריק תת עורית 0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג של Vetergesic לפחות 30 דקות לפני הניתוח. במהלך תקופה זו, להכין את אזור הניתוח. הפעלת כריות חימום ובית הנבחרים התאוששות. מניחים PBS סטרילית באמבט מים חמים כל כלי סטריליים וחומרים על בסדינים מעוקרים. הנח את האלקטרודות לתוך הכוס פלטינה PBS מלא ולהתחבר electroporator. מלאו את המחט עם פתרון ה-DNA באמצעות עצה microloader, חבר את המחט לבעל נימי ולצבוט את קצה המחט עם מלקחיים מספר. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. ניתוח לפני הזרקת ה-DNA ואת electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכבר בהריון (E14.5-E15.5) עם isoflurane במנשא החמצן (חמצן 2 ליטר / דקה) באמצעות חדר אינדוקציה הרדמה. לחכות עד שבעל החיים מאבד ליישר רפלקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את בעל החיים מסכה &quot;טרום ניתוח&quot;. מניחים טיפת ג&#39;ל עיניים על כל עין כדי למנוע כיב בקרנית העיניים בזמן שאמא נמצאת תחת הרדמה כללית. להשתמש במכונת גילוח חשמלית לגלח את השיער של הבטן. לנקות את האזור המגולח פעם עם clorhexidine לאסוף שיער המעופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את בעל החיים המסכה 2 באזור הניתוח. מניחים את העכבר עם גבו על כרית חימום. להתחיל את הניתוח כאשר רפלקס דוושת אבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללבוש מסכה וכפפות סטריליות. כסה את בעל החיים עם וילון סטרילי (עם חור קטן על הבטן) כדי למנוע את רקמות וכלי מלהיות מזוהמים על ידי אזורים של עור שלא היה מגולח וחיטוי. לנקות את האזור מגולחלא לפחות 3 פעמים עם clorhexidine. השתמש מקלון צמר גפן סטרילי שונה בכל פעם. השתמש אזמל לעשות חתך אנכי לאורך קו האמצע (~ 1 ס&quot;מ אורך) דרך העור. באמצעות מספריים, לעשות חתך דומה של שריר הבטן לאורך Linea alba (הקו הלבן מורכב ברובו רקמת החיבור קולגן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את העוברים נגיש ביותר למקם את מלקחיים טבעת בין שני העוברים ובזהירות למשוך את השרשרת עובריים מתוך חלל הבטן. מנקודה זו ואילך, לשמור על העוברים hydrated עם סטרילי מחומם מראש PBS. </li></ol> מיקרוסקופ לא נדרש להדמיה. 4. הזרקת דנ&quot;א electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל עם אחד העוברים לרוחב ביותר, מה שמקל כדי לעקוב אחר שבו היו עוברים electroporated. אל תמשוך יותר מדי על העוברים כמו זה יהיה להעלות את הסיכון של דימום. לשנות את המיקום של העובר בתוך שק מי השפיר באמצעות מלקחיים הטבעת והכבישיםלייצב את הראש של העוברים בין הטבעות. סוחטים בעדינות לדחוף את העובר קרוב יותר לקיר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זאת, לקחת את בעל נימי והכנס את המחט בזהירות למרכז בחצי הכדור לכוון החדר לרוחב. לחצו על הדוושה כדי להזריק כ 1 μl של פתרון ה-DNA מהול מהיר (פחות מ 1 μl ללמוד דנדריטים) הירוק. אתה צריך לראות את הצבע הירוק ממלא את החדר לרוחב. צעדים קריטיים: - חדות של מחט הוא קריטי כדי לחדור כראוי קיר הרחם. חשוב למזער את תנועת המחט על פני השטח של דופן הרחם ואחרי הכניסה לתוך החדר, כי הגדלת החור תגרום דליפת מי שפיר או מוות העובר. הימנע דם פירסינג הכלים דופן הרחם, כמו זה יגרום לדימום ומוות העובר. - חשוב לא להזריק כמות גדולה מדי של ה-DNA לתוך החדר לרוחב כי זה יהיה לגרוםהידרוצפלוס (לא יעלה על 2 μl ב E14.5). נפח של ה-DNA מותאם לפי המטרה של הניסוי. אם 1μl משמש בדרך כלל את רוב הניסויים, נפח קטן יותר של ה-DNA (כ 0.5 μl) נדרש דנדריט ניתוח בעמוד השדרה. ואכן כמה תאים בודדים צריך להיות ממוקד כדי לחזות ולמדוד את סוכת הדנדריטים של נוירונים electroporated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את האלקטרודות בצידי הראש עובר עם משוט (+) חיובי בצד כמו החדר מוזרק עבור electroporation קליפת המוח או בצד השני של החדר מוזרק עבור electroporation ההיפוקמפוס (איור 2). לאחר מכן ליישם חמש פולסים חשמליים 30V (50 msec ומשך) בשעה 1 במרווחים שניות. צעד קריטי: הימנע החלת הנוכחי על פני השליה כמו זה יהיה לגרום למוות העובר. כל העוברים בתוך העכבר בהריון ניתן electroporated, בדרך כלל עם ה-DNA זהה לבנות כדי למנוע בלבול. עם זאת, ירידה ניתוח רב<html> של שיעור ההישרדות של עוברים. חלל הבטן אין לפתוח יותר מ 30 דקות. </li></ol> 5. ניתוח שלאחר electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporating את העוברים, להוסיף PBS לתוך חלל הבטן ולהשתמש מלקחיים טבעת להחליף את קרן הרחם במיקומו המקורי. לתפור קיר הבטן והעור עם התפרים נספגים Vicryl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה בחדר ההתאוששות עד שהוא מתעורר (בדרך כלל 5-10 דקות) ולאחר מכן להעביר בכלוב מונח על כרית חימום. </li></ol> 6. לאחר הניתוח בדוק את התנהגות העכברים להעריך, סבל או מצוקה ולשקול את החיות 24 שעות ו 48 שעות לאחר הניתוח. במידת הצורך, משככי כאבים יכולים להינתן כדי למזער את הכאב ואי הנוחות. 7. עיבוד רקמות לאסוף את עוברי electroporated או גורים בשלבים עובריים או לאחר הלידה הנדרשים לניסוי. ove_content &quot;&gt; - לניתוח בשלבים עובריים (למשל ללמוד התפשטות תאים או הגירה): האם להרדים באמצעות פריקה צוואר הרחם ולאסוף את העוברים. לאחר עריפת ראש, בחר את המוח, כי כבר electroporated כראוי, כפי שמעידה כמות ומיקום של אות ניאון, דמיינו פני הגולגולת באמצעות המשקפת ניאון. לנתח את המוח של הגולגולת ולתקן לילה PFA 4% ולאחר מכן מקום סוכרוז 20% / PBS לילה. שבץ במתחם אוקטובר, הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס, תוך שימוש בסעיף cryostat. - לניתוח בשלבים לאחר הלידה (למשל ללמוד דנדריטים עמוד השדרה): להרדים גורים או עכברים בוגרים עם הזרקת intraperitoneal של pentobarbitone (40-60 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ולבצע זלוף transcardial עם PBS, ואחריו PFA 4% ב PBS. לנתח את המוח של הגולגולת ואחרי תיקון ב 4% PFA לילה. לאחר כביסות ב PBS, סעיף המוח באמצעות vibratome (סעיפים 100 מיקרומטר עבור דendrite ניתוח). הר את הסעיפים אקווה פולי / הר באמצעות 0.16-0.19 coverslips מ&quot;מ עובי על דנדריטים התמונה ואת עמוד השדרה. 8. נציג תוצאות איור 3 מציג דוגמאות של תאים electroporated בקליפת המוח (3A דמויות, ב), CA1 (איורים 3 ג, ד) וכן gyrus משוננת של ההיפוקמפוס (איורים 3E, F). Wild-type עכברים היו electroporated ב E14.5 עם מבנה ה-GFP (PCA-B-EGFPm5 משתיק 3) ומוח נבצרו ב יום לאחר הלידה (p) 14. על ידי הזרקת נפח קטן של פתרון ה-DNA (0.5 μl פחות או פתרון ב מיקרוגרם 1 / μl), תאים כמה מסומנים, אשר מאפשר הדמיה של arborization הדנדריטי של בודדים GFP + תאים (איור 3), כמו גם עמוד שדרה בהגדלה גבוהה יותר (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" /> &lt;strong&gt; באיור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקולים electroporation שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד דנדריטים עמוד השדרה. (א) electroporation של ה-GFP בונים להשוות דנדריטים עמוד שדרה אצל עכברים wild-type ו מוטציה. (ב) electroporation של ה-GFP-shRNA (GFP מתבטא בין מבנה זהה) להשוות דנדריטים הקוצים עכברים electroporated עם shRNA לבנות ספציפית הגן של עניין (X) או shRNA שליטה. (ג) IUE יכול לשמש יחד עם מערכת מושרה Cre כדי להגביל ביטוי shRNA תקופת זמן רצויה. בניסוי זה, וקטור לבטא סוג של recombinase Cre שיכול להיות מופעל על ידי 4-hydroxytamoxifen (החטיבה ER-T2 קואל T2: 1 מיקרוגרם / μl) 10, הוא electroporated יחד עם הווקטור המבטא shRNA ספציפי תלויה Cre באופן (1 מיקרוגרם / μl, ועם מדד רקומבינציה (CALNL-GFP מבנה, מושרה GFP ביטוי על ידי Cre,. 1 מיקרוגרם / μl) 10 efficienסי של מציאה ניתן לשפר על ידי הגדלת ריכוז shRNA כמו גם הגדלת החטיבה ER-T2 ריכוז קואל T2. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" /> איור 2. השליטה במרחב של electroporation. נתון זה מראה היכן למקם את האלקטרודות ההנעה על פי הזריקה ה-DNA על מנת למקד את קליפת המוח או ההיפוקמפוס. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" /> איור 3. ויזואליזציה של ארבור הדנדריטי של ברחם electroporated תאים בקליפת המוח להיפוקמפוס מוחין. (א, ב) סעיפים העטרה מראה GFP + תאים פירמידליים בקליפת המוח, (CD) תאים פירמידליים ב CA1 של ההיפוקמפוס ו (E, F), תאים גרגיר של gyrus משוננת ב P14. מבנה ה-GFP (PCA-B-EGFPm5 משתיק 3) היה electroporated ב E14.5. תמונות הגדלה גבוהה (B, D, F) עולה כי IUE היא שיטה יעילה לחזות דנדריטים. ברים בקנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר (B, D ו-F), 150 מיקרומטר (A, C, E). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" /> איור 4. ויזואליזציה של הקוצים הדנדריטים ב p14 נוירונים שהיו electroporated ברחם ב E14.5 עם GFP להביע לבנות. (A, B) תמונות בהגדלה גבוהה של עמוד השדרה של הבסיס דנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס פירמידליים. ברים בקנה מידה מייצגים 5 מיקרומטר (א) ו -2 מיקרומטר (ב &#39;).

<ol>
	<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders.">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> Front Mol. Neurosci. 4, 37 (2011).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Dev. Growth Differ. 50, 499-506 (2008).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).</li><li>Castro, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+the+proneural+factor+Ascl1+in+progenitor+proliferation+identified+by+genome-wide+characterization+of+its+targets.">A novel function of the proneural factor Ascl1 in progenitor proliferation identified by genome-wide characterization of its targets.</a> Genes Dev. 25, 930-945 (2011).</li><li>Pacary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proneural+transcription+factors+regulate+different+steps+of+cortical+neuron+migration+through+Rnd-mediated+inhibition+of+RhoA+signaling.">Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling.</a> Neuron. 69, 1069-1084 (2011).</li><li>Marteau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2+regulates+cortical+neurogenesis+in+the+developing+telencephalon.">Angiopoietin-2 regulates cortical neurogenesis in the developing telencephalon.</a> Cereb Cortex. 21, 1695-1702 (2011).</li><li>Ramon Moliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparative Methods in Neuroanatomy. , (1970).</li><li>Banks, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+other+phenotypes+in+a+cytoplasmic+Dynein+light+intermediate+chain+1+mutant+mouse.">Behavioral and other phenotypes in a cytoplasmic Dynein light intermediate chain 1 mutant mouse.</a> J. Neurosci. 31, 5483-5494 (2011).</li><li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development.">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20953-20958 (2008).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. o. n. g. -. t. e. r. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation.">selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).</li><li>Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopia+formation+in+rat+but+not+mouse+neocortex+after+RNA+interference+knockdown+of+DCX.">Heterotopia formation in rat but not mouse neocortex after RNA interference knockdown of DCX.</a> Cereb Cortex. 16, 1323-1331 (2006).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

IUE הוא כלי רב עוצמה כדי לתפעל ביטוי גנים לא רק במרחב אלא גם בזמן. אנחנו מראים כאן טכניקה זו ניתן להשתמש כדי להמחיש גנטית לתפעל דנדריטים הקוצים בקליפת המוח ו בהיפוקמפוס של עכברים. מלבד היתרונות שצוינו לעיל, ראוי לציין כי IUE, בניגוד Golgi השיטה, ניתן לשלב עם אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתרו, מה שמאפשר למשל פנוטיפ התאים electroporated. כמו כן, חשוב לציין כי הליך זה אינו לגרום מומים במוח שנרשמה למרות הפולשנות היחסי. בנוסף, ברמה התאית, IUE לא לשנות את המאפיינים של אלקטרו נוירונים electroporated 13. בעוד ההפגנה שלנו מתמקד להדמיה של מורפולוגיות דנדריט ועמוד השדרה, IUE של נוירונים בקליפת המוח או בהיפוקמפוס ב E14.5 יכול לשמש גם כדי ללמוד את אירועי התפתחותיות אחרות כגון היווצרות האקסון והדרכה. בהוספהition, אותו סוג של פרוטוקול יכול להיות מיושם בשלבים אחרים של ההתפתחות העוברית למקד אוכלוסיות שונות. לדוגמה, הפרדיגמה electroporation התפתחותית מאוד קליפת המוח מאוחר E18.5 ניתן לבצע לנהוג ביטוי אבות astrocytic 1. באופן דומה, תוך electroporation של ההיפוקמפוס ב E14.5 מאפשר למקד-CA1 CA3 אבות נוירונים פירמידליים ו אב משוננת גרעין התא בו זמנית, electroporation ההיפוקמפוס מאוחר (E18.5 או לאחר לידה מוקדמת) תאפשר למקד גרגיר משוננת שונה אבות 14. במקרה זה, נפח מוזרק של ה-DNA יכול לגדול, כמו גם האינטנסיביות של הנוכחי. Transgenes הציג IUE מופיעים להישאר episomal והם איבדו ולכן מתאים בעקבות חלוקות עוקבות. בתאים postmitotic כמו נוירונים, לעומת זאת, את transgenes episomal יישאר פעיל במשך חודשים לאחר electroporation המאפשר מחקרים ארוכי טווח 13, 15. במחקר שלנו, ראינו GFP בהיר + תאים עד 7 שבועות לאחר הלידה (נקודת הזמן האחרונה ניתחנו) המצביעים על כך עובריים המיקוד של מבשרי נוירונים בקליפת המוח או בהיפוקמפוס באמצעות תוצאות IUE בביטוי מתמשך של transgene מן המוקדמות נקודות זמן התפתחותיים עד לבגרות. המגבלה הנוכחית של הטכניקה היא כי קשה להפעיל בקרה טובה על המספר הכולל של תאים electroporated. עם זאת, על ידי הפחתת נפח מוזרק של פתרון ה-DNA, הראינו כי ניתן לסמן מספר תאים ו לדמיין arborization הדנדריטים של תאים מבודדים + GFP, כמו גם עמוד שדרה. מימד של האזור transfected יכול גם להיות מותאם על ידי שינוי הפרמטרים של electroporation כגון עוצמת הזרם ומספר פעימות או בקוטר של משוטים electroporation. בסך הכל IUE היא שיטה כי הוא קל ליישום, מהיריעיל ללמוד דנדריטים הקוצים vivo.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> הכנת מחטים פתרון ה-DNA של הזרקה </td></tr><tr><td> Endofree ערכת מקסי פלסמיד </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> מהיר גרין </td><td> סיגמא </td><td> F-7258 </td><td></td></tr><tr><td> ההתכה של זכוכית בורו נימים 1.0 מ&quot;מ OD x 0.58 מ&quot;מ מזהה </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 30-0016 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader טיפים </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956003 </td><td> עבור Eppendorf טפטפות 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl </td></tr><tr><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td> חומר לניתוח </td></tr><tr><td> דקות נוספות איריס מספריים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> מעוקלים מלקחיים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 91197-00 </td><td></td></tr><tr><td> טבעת מלקחיים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11103-09 </td><td></td></tr><tr><td> מחט בעל </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 12002-12 </td><td></td></tr><tr><td> גרפה מלקחיים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> תפר נספג Vicryl </td><td> Ethicon Inc (Johnson &amp; Johnson) </td><td> W9074 </td><td></td></tr><tr><td> בסדינים מעוקרים 30 ס&quot;מ x 45 ס&quot;מ </td><td> באסטר </td><td> 141765 </td><td></td></tr><tr><td> מטליות סטריליות </td><td> Shermond </td><td> HUBY-340 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> כותנה ניצנים </td><td> נקי הצלב ושות&#39; בע&quot;מ </td><td> 1860 </td><td></td></tr><tr><td> עצירות (Vetergesic) </td><td> Alstoe לבריאות בעלי חיים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clorhexidine </td><td> Vetasept </td><td> XHG007 </td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;ל עיניים Viscotears </td><td> נוברטיס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> אבוט מעבדות </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Pentoject, נתרן Pentobarbitone 20% </td><td> Animalcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Electroporation </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> פלטינום Tweezertrod5 מ&quot;מ דואר </td><td> BTX, הרווארד Apparatus </td><td> 45-0489 </td><td></td></tr><tr><td> Femtojet microinjector </td><td> Eppendorf </td><td> 5247000030 </td><td></td></tr><tr><td> שליטה ברגל Femtojet Microinjector </td><td> Eppendorf </td><td> 5247623002 </td><td></td></tr><tr><td> נימי בעל </td><td> Eppendorf </td><td> 5176190002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> עיבוד רקמות </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> סיגמא </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> VWR (Prolabo) </td><td> 27480.294 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות </td><td> ThermoScientific (מנצל-גלזר) </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> מנצל-גלזר </td><td></td><td> 22 x 50 מ&quot;מ # 1,5 </td></tr><tr><td> אקווה פולי / הר </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 18606 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation

ב electroporation ברחם (IUE) הפך טכניקה רבת עוצמה כדי לחקור את הפיתוח של אזורים שונים של מערכת העצבים העוברית 1-5. עד היום בכלי זה נעשה שימוש נרחב על מנת ללמוד את הרגולציה של התפשטות התמיינות, וכן העברה עצבית בעיקר את קליפת המוח המתפתח 6-8. כאן יש פירוט הפרוטוקול שלנו electroporate ברחם קליפת המוח ואת ההיפוקמפוס לספק ראיות כי גישה זו ניתן ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים. ויזואליזציה ומניפולציה של נוירונים תרבויות עיקריות תרמו להבנה טובה יותר של התהליכים המעורבים דנדריט, עמוד השדרה ופיתוח סינפסה. עם זאת נוירונים הגדלים במבחנה אינם חשופים כל סימנים פיזיולוגיים שיכולים להשפיע על דנדריט ו / או יצירת עמוד השדרה ותחזוקה במהלך התפתחות תקינה. הידע שלנו של מבנים דנדריט ועמוד השדרה <eמ &#39;&gt; in vivo בעכברים wild-type או מוטציה מגיע בעיקר תצפיות בשיטת Golgi-קוקס 9. עם זאת, מכתים Golgi נחשב בלתי צפוי. אכן, קבוצות של תאים עצביים ועל קטעי סיבים מסומנים באופן אקראי, עם אזורים מסוימים מופיעה לעתים קרובות מוכתם לחלוטין בעוד אזורים סמוכים ללא כתמים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי IUE של מבנים ניאון מהווה שיטה חלופית אטרקטיבית ללמוד דנדריטים, עמוד שדרה, כמו גם את הסינפסות עכברים שעברו מוטציה / wild-type 10-11 (איור 1 א). יתר על כן, בהשוואה לדור של knockouts עכבר, IUE מייצג גישה מהירה לבצע רווח והפסד של מחקרים פונקציה באוכלוסייה ספציפית של תאים במהלך חלון זמן מסוים. בנוסף, IUE שימש בהצלחה עם ביטוי הגן או מושרה מושרה RNAi מתקרב כדי לחדד את השליטה הזמני על הביטוי של הגן או shRNA 12. אלו יתרונות יש IUE ובכך openeד מימדים חדשים כדי ללמוד את ההשפעה של ביטוי גנים / דיכוי על דנדריטים עם קוצים לא רק מבנים מוחיים ספציפיים (איור 1 ב), אלא גם בנקודת זמן מסוימת של פיתוח (איור 1 ג). לבסוף, IUE מספקת כלי יעיל לזהות אינטראקציות תפקודית בין גנים המעורבים דנדריט, עמוד השדרה ו / או פיתוח סינפסה. ואכן, בניגוד לשיטות אחרות העברת גנים כמו וירוס, זה פשוט לשלב מספר רב של RNAi או transgenes באוכלוסייה זהה של תאים. לסיכום, IUE היא שיטה רבת עוצמה אשר תרמו כבר אפיון של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תפקוד המוח ומחלות והיא צריכה להיות שימושית גם במחקר של דנדריטים עמוד השדרה.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation at JoVE.com

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול electroporate ברחם לבין קליפת המוח להיפוקמפוס ב E14.5 בעכברים. כמו כן, אנו מראים כי מדובר בשיטה בעלת ערך ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...