Name: an in vitro co-infection model to study plasmodium falciparum-hiv-1 interactions in human primary monocyte-derived immune cells
Uploaded: 2012-08-15T13:00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den canadiske Institutes of Health Research gennem en katalysator Co-infektioner og Komorbiditet tilskud. Humane erythrocytter blev fremlagt af den Centre Hospitalier de l&#39;Université Laval blodbank.

Bemærk: Eksperimenter med HIV-1 og Plasmodium falciparum skal udføres i den rette biosikkerhedsniveau laboratorier (BSL2 for parasitter, og BSL3 for HIV-1 og co-infektioner) og særlige forholdsregler skal tages ved brug af potentielt inficeret blod. 1. Perifere, mononukleare blodceller (PBMC) Oprensning (Baseret på 8 og 9) <ol><li> Begynde med frisk humant blod fra sunde donorer (500 ml) blev behandlet med antikoagulanter (heparin, citrat, surt citrat-dextrose-eller citrat-phosphat dextrose). Brug endotoxin-fri reagenser, når rensning og isolere PBMC og resten af ​​protokollen. </li><li> Desinficere blod posen, inklusive rør med 70% ethanol, skæres røret og omhyggeligt overføre blod i en T150 kolbe. </li><li> Forbered 16 rør med 15 ml Lymfocytter Separation Medium (Ficoll) per 50 ml konisk rør (sørg for, at Ficoll har nået stuetemperatur).Forsigtigt lag 30 ml frisk blod ovenpå. </li><li> Centrifuger ved 400 xg i 30 minutter ved 20 ° C med afbrydes. </li><li> Under centrifugering fremstilling 8 x 50 ml koniske rør med 25 ml stuetemperatur Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) per rør. </li><li> Omhyggeligt overføre uklar cellen ring ved grænsefladen (indeholder PBMC) til 50 ml røret indeholdende HBSS (pool 2-celler ringe pr rør). Fuldføre volumener op til 50 ml med HBSS. </li><li> Centrifuger ved 150 xg i 15 min ved 20 ° C med pauser på. </li><li> Under centrifugering af den uklare cellen ring, opsamle den gule øvre lag af Ficoll trin, pool plasmaet til at fylde et 50 ml konisk rør. Inaktivere supplere i plasma ved opvarmning af 50 ml rør ved 56 ° C i 30 minutter og spin 10 minutter ved 1800 x g. Holde supernatanten (indeholdende fortyndet autologt plasma, der kan anvendes som medium supplement på senere trin). </li><li> Fjern forsigtigt supernatanten og resuspend cellepelleten fra trin 1,7 i 25 ml HBSS og pool 2 pellets pr 50 ml rør. Spin ved 300 xg i 8 minutter ved 20 ° C. </li><li> Fjern supernatanten omhyggeligt og resuspender pellets i 10 ml HBSS og pool i en 50 ml rør. </li><li> Tag en alikvot, udføre trypanblåteksklusion at vurdere dødelighed og derefter tælle PBMC. </li><li> Fuldstændig volumen til 50 ml med HBSS og centrifugering i 10 minutter ved 300 x g. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i RPMI 1640 ved 5x10 6 celler / ml (man skal opnå ca 400-500 x 10 6 PBMC fra 500 ml blod). </li></ol> 2. Monocytter-afledte makrofager (MDM) differentiering (Baseret på 8 og 9) <ol><li> Frø ca 1,25 x 10 8 PBMC i 15 cm skåle med RPMI 1640 (25 ml / skål). </li><li> Lad celler klæber i 1-2 timer ved 37 ° C med 5% CO2 atmosfære. </li><li> Overfører ikke-adhærerede celler i en ny kolbe og vaskes pladen med 15 ml endotoxin-fri PBS to gange (5min, 300 xg). De klæbede celler isoleres monocytter. </li><li> At tillade frisk isolerede monocytter til at differentiere til MDM, tilsættes 20 ml RPMI 1640-medium suppleret med 5% autologt plasma (fra trin 1.8). Tilsættes human rekombinant makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF, 25 ng / ml) og penicillin / streptomycin-opløsning (PS, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin). Inkuber i 2 dage, ændre medium og inkuberes 2-3 ekstra dage ved 37 ° C i 5% CO2-atmosfære. </li><li> Fjern gammelt medium og vask med endotoxin-fri PBS en gang, tilføje PBS forsigtigt og aspirér straks. At frigøre fuldt differentierede MDM behandle celler med -7 ml Accutase (Accutase, en kommercielt tilgængelig blanding af proteaser og collagenolytisk aktivitet, der tillader frigørelse af cellerne fra plastskål) i 15-20 minutter ved 37 ° C i en 5% COz 2 atmosfære, rokke roligt midt-tid. </li><li> Tilsæt 3-5 ml autologt plasma (fra trin 1,8) i hver plade (til at beskytte de celler, mensskrabning). </li><li> Forsigtigt skrabe cellerne at sikre, at mediet omfatter celler på alle tidspunkter og transfer / pool i en 50 ml rør. </li><li> Skylles pladerne med endotoksin-fri PBS at genvinde så mange celler som muligt. </li><li> Spin 5 minutter ved 200 xg, kasseres supernatanten. </li><li> Resuspender pellet i 5 ml MDM dyrkningsmedium (RPMI 1640 suppleret med 10% komplement-inaktiveret kalvefosterserum (iFBS), PS, 25 mM HEPES) og tælle celler (MDM udbytte sædvanligvis 2-8% af den samlede PBMC). Bemærk: en alikvot af MDM kan træffes på dette trin at vurdere cellepopulation renhed ved flowcytometri, som regel 99% af opnået MDM Express CD14. </li><li> Frø 1x10 5 MDM i 600 pi MDM dyrkningsmedium pr brønd i 24-brønds plader. </li><li> Inkuber natten over ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære før infektion. </li></ol> 3. Produktion og Kvantificering af HIV-1-virale stamopløsninger <ol><li> Producere virale stamopløsninger med calciumphosphat-transfektion i HEK293T celler Follofløj protokollen af Fortin et al. 10. </li><li> For at opnå en enkelt cyklus vira indeholdende luciferase-kodende reportergen, co-transficere HEK293T celler med enten 20 ug NL4.3 Luc + Env - R + og 10 ug af pHCMV-G, eller 15 ug NL4.3 Luc + Env - R + og 15 ug pJRFL ENV. Bruger 30 ug NL4.3 Luc + Env - R + til frembringelse kontrol glycoprotein-deficiente vira. Det fuldt replikative virus, anvendes 30 ug NL4.3Bal env. Vektorerne pHCMV-G og pJRFL env koder kappeglycoproteinerne af vesikulær stomatitisvirus (VSV-G) og en CXCR5-tropisk HIV-1 (andet end NL4.3Bal env), hhv. Yderligere oplysninger om de plasmider kan opnås fra 8. Plasmider kan opnås gennem NIH AIDS Research and Reference Program (NIAID, NIH). </li><li> Kvantificere alle virale stamopløsninger under anvendelse af ELISA for HIV-1 p24 capsidprotein 11, Og kontrollere deres infektiøse potentiale før brug. Vurderer vi infektiviteten af vore virusstammer ved anvendelse af TZM-bl indikatorceller 12. </li></ol> 4. Culture of Plasmodium falciparum Parasitter (Baseret på 13) 4,1 General kultur og vedligeholdelse af parasitter <ol><li> Vedligehold P. falciparum 3D7 ukønnede stadium parasitter i humane erythrocytter (blodgruppe O +) i en 4% hæmatokrit i RPMI 1640 (bufret med 25 mM HEPES og 25 mM NaHCO3) suppleret med 0,5% (w / v) Albumax II, 25 ug / ml gentamicin og 370μM Hypoxanthin ved 37 ° C i en gasblanding af 1% oxygen / 5% carbondioxid i nitrogen. </li><li> Parasitæmi kan overvåges ved at foretage en tynd smear af kulturen og farvning med en 15% Giemsa-opløsning. </li><li> Altid opretholde en ikke-inficerede røde blodlegemer (uRBC) dyrkningsskålens i de samme betingelser som parasitter at bruge som en kontrol. Til opnåelse af sent Parasites (trofozoitter / tidlig schizonts), synkronisere de parasitter som følger: </li></ol> 4,2 Parasite synkronisering <ol><li> Om morgenen, høste parasitten kultur, spin 5 minutter ved 300 xg og kassér supernatanten. </li><li> Resuspender pellet i 5 hæmatokrit volumener med 5% (w / v) D-sorbitol og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C. </li><li> Spin 5 minutter ved 300 x g, kasseres supernatanten, resuspender pelleten i 30 ml dyrkningsmedium og sættes tilbage i inkubatoren. </li><li> Ca. 8 timer senere, gentag trin 4.2.1 til 4.2.3 for at opnå tæt synkroniserede parasitter. Sent parasitter (trofozoitter / begyndelsen af ​​schizonts) kan derefter høstes den følgende morgen for at udføre eksperimentet. Forud for rensning, udføre Giemsa farvning for at bekræfte livscyklus fase. </li></ol> 4.3 Plasmodium falciparum-inficerede røde blodlegemer (iRBC) oprensning <ol><li> Steriliser VarioMacs separator (stativ og magnet) med 70% ethanol og pkniplinger den under biologiske hætten. </li><li> Fastgør tre-vejs stophane til CS kolonne bunden. </li><li> Klip enden af ​​nålen plast beskytter med Miltenyi specielle kniv og fastgør nålen til stophane bunden. </li><li> Lås kolonne i magneten forsigtigt. </li><li> Fjerne alle luftbobler i søjlen ved langsomt at injicere 10 ml MDM dyrkningsmedium med kittet lukkede sprøjte skruet på den venstre side af hanen. </li><li> Vask kolonne med ~ 20 ml MDM dyrkningsmedium. </li><li> Høst RBC fra dyrkningspladen, vaskes en gang med 10 ml MDM medium (300 x g, 5 min) og resuspenderes RBC pelleten i 12 ml MDM dyrkningsmedium. Tilsættes langsomt til søjlen, og lade suspensionen strømme igennem (kun inficerede røde blodlegemer indeholdende parasitter i trofozoit eller schizont trin vil blive tilbageholdt af det magnetiske felt på grund af tilstedeværelsen af ​​hemozoin krystaller). </li><li> Vaskes en gang med 20 ml medium og stopper væskestrømning, når den når den hvide disken på toppen af ​​søjlen. </li><li>Fjerne søjlen fra magneten og elueres iRBC i et rent sterilt rør med 12 ml MDM dyrkningsmedium. </li><li> Smear en portion af det udvundne iRBC og udføre Giemsa farvning for at bekræfte livscyklus fase. </li><li> Tæller udvindes iRBC anvendelse af et hæmocytometer (isoleret RBC 100% iRBC). </li><li> Udpelleter cellerne (300 xg, 5 min), kasseres supernatanten og behandle celler med 500 pi frisk AB + humant serum (opsonisering trin 14). </li><li> Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. </li><li> Vaskes en gang med 10 ml MDM dyrkningsmedium (300 x g, 5 min) og resuspender iRBC til den ønskede koncentration. Sædvanligvis en 10% parasitæmi 15 cm dyrkningsskål ca giver ~ 0,5-1x10 8 tæt synkroniseret iRBC. </li></ol> 5. Eksponering af MDM til Plasmodium falciparum <ol><li> At udsætte MDM til uRBC eller iRBC, skal cellerne resuspenderes i MDM dyrkningsmedium for at opnå et forhold på uRBC / iRBC: MDM af 75:1. I tidligeretilberedte 24-brønds plader indeholdende MDM og tilføje passende RBC-suspension volumen til hver brønd. Udfører alle forsøg i triplikat. </li><li> Inkuber co-kulturer i 4 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. </li><li> Vask cellerne med 600 pi endotoxinfri PBS 3 gange, og der tilsættes PBS forsigtigt opsuges øjeblikkeligt. </li><li> At lysere de resterende RBC, vaskes brøndene ved tilsætning af 200 pi iskold sterilt vand i 20 sekunder og aspirat. </li><li> Tilsættes 600 pi MDM dyrkningsmedium og inkuberes 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. </li></ol> 6. Infektion af MDM med et fuldt Replikativ HIV-1 <ol><li> For at vurdere virkningen af P. falciparum på HIV-1 replikation i MDM tilsættes, ifølge skemaet angivet i figur 1A, 10 ng af p24 (i 300 pi MDM medier) af NL4.3Bal env vira i de passende brønde; kun tilføjer MDM medium i kontrolbrønde . </li><li> Inkuber 2 h ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. </li><li> Vask cellerne med endotoxinfri PBS 3 gange, og der tilsættes PBS forsigtigt opsuges øjeblikkeligt. Tilsættes 600 pi af frisk MDM medium per brønd. </li><li> Inkuber ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. </li><li> På dag 3, 6, efter 9 og 12 i begyndelsen af ​​viral infektion, høst 200 pi af hver supernatant, tilsætning af 200 pi frisk MDM medium derefter. Holde de høstede supernatanterne ved -20 ° C til kvantificering af de store HIV-1-capsid p24-protein ved ELISA efter Fortin et al. 10. </li></ol> 7. Infektion af MDM med enkelt cyklus Virus kodning Luciferase <ol><li> For at bestemme parasittens virkning på HIV-1 genekspression i MDM tilsættes, ifølge skemaet angivet i figur 1B, 10 ng p24 (i 300 pi MDM medium) af enten NL4.3 Luc + Env - R + ( VSV-G), NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL ENV) eller NL4.3 Luc +Env - R + virus i de relevante brønde. </li><li> Inkuber 2 h ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. </li><li> Vask cellerne med 600 pi endotoxinfri PBS 3 gange, og der tilsættes PBS forsigtigt opsuges øjeblikkeligt. Tilsættes 600 pi af frisk MDM medium per brønd. </li><li> Inkuber ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære. </li><li> Fjernelse af mediet 72 timer efter infektion, og der tilsættes 200 pi lysisbuffer 1X (leveret med luciferase assay kit). Lod cellerne lyseres ved stuetemperatur med forsigtig rystning. Opbevar ved -20 ° C. </li><li> Optø pladen, og overfør 40 pi af lysatet til en 96-brønds luminometer plade; tilsættes 100 ul luciferase substrat (leveret med luciferase assay kit), og måle luciferase (ildflue luciferase-aktivitet) i et luminometer efter producentens instruktioner. </li></ol> 8. Repræsentative resultater Ved hjælp af vores co-infektion model, viser vi, at exposure af P. falciparum til MDM falder deres modtagelighed for HIV-1 infektion. Faktisk en signifikant fald (p &lt;0,05; 2 ANOVA, dag 12) i ​​frigivelsen af viruspartikler, som målt ved HIV-1 p24 capsid protein i supernatanten, der observeres i MDM forbehandlet med parasitter (figur 2A). Denne observation er bekræftet i celler inficeret med vira, der koder en luciferase-reportergen. MDM infektion med sådanne vira indeholdende enten exogene VSV-G-eller HIV-1 glycoproteiner fører til signifikant (p &lt;0,05, Student t-test) mindre luciferase produktion i celler udsat for P. falciparum (figur 2B). Det er bemærkelsesværdigt, at VSV-G-pseudotype virus viste meget større luciferaseaktivitet end deres JRFLenv modparter, hvilket skyldes den større infektion effektiviteten af VSV-G-pseudotypet partikler 15. I betragtning af at parasitten udsættelse for MDM virkninger begge typer virus, dette tyder på, at det påvirker nogle skridt i viral gen exsion (figur 2B). Det er også vigtigt at nævne, at cellelevedygtigheden blev ikke påvirket af MDM udsættelse for iRBC (data ikke vist), hvilket indikerer, at den observerede inhibering er specifik og ikke på grund af cellemortalitet. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig1.jpg" /> Figur 1. A) Plade ordning for MDM infektion med et fuldt replikativt virus Mock:. Inficerede celler. uRBC: celler udsat for uinficerede røde blodlegemer. iRBC: celler udsat for Plasmodium falciparum-inficerede røde blodlegemer. Bal: celler inficeret med NL4.3Bal env Bal / uRBC. Celler udsat for uRBC og inficeret med NL4.3Bal env Bal / iRBC.. Celler udsat for iRBC og inficeret med NL4.3Bal env B) Plade ordning for MDM infektion med enkelt cyklus luciferase-kodende virus Mock. uinficerede celler. uRBC: celler udsat for uinficerede røde blodlegemer. iRBC: celler udsat for Plasmodium falciparum-infected røde blodlegemer. Δenv: celler inficeret med NL4.3 Luc + Env - R + JRFL:. Celler inficeret med NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL ENV). VSV-G: celler inficeret med NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G) Δenv / uRBC.. celler udsat for uRBC og inficeret med NL4.3 Luc + Env-R + Δenv / iRBC: celler udsat for iRBC og inficeret med NL4.3 Luc + Env - R + JRFL / uRBC: celler udsat for uRBC og inficeret med NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL ENV).. JRFL / iRBC: celler udsat for iRBC og inficeret med NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL ENV). vsv-g/uRBC: celler udsat for uRBC og inficeret med NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G) vsv-g/iRBC. celler udsat for iRBC og inficeret med NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/&gt; Figur 2. . A) Effekt af Plasmodium falciparum på HIV-1 virus produktion i MDM MDM blev eksponeret for uRBC eller iRBC i et forhold 75:1 (uRBC / iRBC: MDM) i 4 timer og vasket grundigt. Celler blev inficeret med 10 ng NL4.3Bal env p24 i 2 timer. Virusproduktion blev overvåget ved ELISA for HIV-1 p24 i celle-fri supernatant på forskellige tidspunkter efter initial virusinfektion. Et repræsentativt eksperiment er vist B) Virkning af Plasmodium falciparum på HIV-1 viral transkription i MDM MDM blev inficeret med uRBC eller iRBC i et forhold 75:1 (uRBC / iRBC.. MDM). Cellerne blev derefter inficeret med 10 ng af p24 i en enkelt cyklus virus (enten NL4.3 Luc + Env - R +, NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env) eller NL4.3 Luc + Env - R + (VSV- g)). Luciferase-ekspression blev vurderet i cellelysaterne 72 timer efter første virusinfektion. Et repræsentativt eksperiment er vist.

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2005).</li><li>Kublin, J. G., Patnaik, P., Jere, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Plasmodium+falciparum+malaria+on+concentration+of+HIV-1-RNA+in+the+blood+of+adults+in+rural+Malawi:+a+prospective+cohort+study.">Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study.</a> Lancet. 365, 233-240 (2005).</li><li>Cuadros, D. F., Branscum, A. J., Crowley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-malaria+co-infection:+effects+of+malaria+on+the+prevalence+of+HIV+in+East+sub-Saharan+Africa.">HIV-malaria co-infection: effects of malaria on the prevalence of HIV in East sub-Saharan Africa.</a> Int. J. Epidemiol. 40, 931-939 (2011).</li><li>Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+antigen-induced+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+is+mediated+through+induction+of+tumor+necrosis+factor-alpha.">Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha.</a> J. Infect. Dis. 177, 437-445 (1998).</li><li>Froebel, K., Howard, W., Schafer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+malaria+antigens+renders+mononuclear+cells+susceptible+to+HIV+infection+and+re-activates+replication+of+endogenous+HIV+in+cells+from+HIV-infected+adults.">Activation by malaria antigens renders mononuclear cells susceptible to HIV infection and re-activates replication of endogenous HIV in cells from HIV-infected adults.</a> Parasite Immunol. 26, 213-217 (2004).</li><li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+derived+from+hemozoin-loaded+monocytes+display+a+partial+maturation+phenotype+that+promotes+HIV-1+trans-infection+of+CD4++T+cells+and+virus+replication.">Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication.</a> J. Immunol. 184, 2899-2907 (2010).</li><li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+hemozoin+modulates+susceptibility+of+immature+monocyte-derived+dendritic+cells+to+HIV-1+infection+by+inducing+a+mature-like+phenotype.">Malaria hemozoin modulates susceptibility of immature monocyte-derived dendritic cells to HIV-1 infection by inducing a mature-like phenotype.</a> Cell Microbiol. 12, 615-625 (2010).</li><li>Diou, J., Gauthier, S., Tardif, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+the+malaria+pigment+hemozoin+renders+human+macrophages+less+permissive+to+HIV-1+infection.">Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages less permissive to HIV-1 infection.</a> Virology. 395, 56-66 (2009).</li><li>Davies, J. Q., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+human+macrophages.">Isolation and culture of human macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 290, 105-116 (2005).</li><li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity.">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li><li>Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+host+ICAM-1+in+laboratory+and+clinical+strains+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+increases+virus+infectivity+and+CD4(+)-T-cell+depletion+in+human+lymphoid+tissue,+a+major+site+of+replication+in+vivo.">Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo.</a> J. Virol. 76, 1004-1014 (2002).</li><li>Wei, X., Decker, J. M., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+patients+receiving+fusion+inhibitor+(T-20)+monotherapy.">Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193, 673-675 (1976).</li><li>Turrini, F., Ginsburg, H., Bussolino, F., Pescarmona, G. P., Serra, M. V., Arese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+human+red+blood+cells+by+human+monocytes:+involvement+of+immune+and+nonimmune+determinants+and+dependence+on+parasite+developmental+stage.">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage.</a> Blood. 80, 801-808 (1992).</li><li>Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+CD34++cells+with+a+human+immunodeficiency+virus+type+1-based+retroviral+vector+pseudotyped+with+vesicular+stomatitis+virus+envelope+glycoprotein+G.">High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G.</a> J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).</li><li>Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+infantum+enhances+human+immunodeficiency+virus+type-1+replication+in+primary+human+macrophages+through+a+complex+cytokine+network.">Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network.</a> Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Vi har vist her to forskellige fremgangsmåder til at analysere virkningen af ​​malariaparasitten på HIV-1 virale cyklus, dvs ved at analysere enten viral genekspression eller afkom virusproduktion og replikation i monocyt-afledte makrofager. Lignende fremgangsmåder er blevet anvendt til andre HIV-1-parasit co-infektioner 16. Men disse nye data er et skridt fremad i undersøgelsen af ​​malaria-HIV-1 co-infektioner. . Faktisk Diou et al 8 undersøgte effekten af hemozoin, ikke levende parasitter, på HIV-1 replikation, i overensstemmelse med vores resultater, observerede de, at hemozoin i sig selv var tilstrækkelig til at hæmme viral produktion af MDM, og ikke MDMs. Brug den beskrevne eksperimenterende layout, vi observeret, at P. falciparum udøver en klar negativ virkning på HIV-1 replikativ cyklus i makrofager: en signifikant inhibering af viral produktion observeret i makrofager forhånd udsat for parasitter (Figure 2A) og en specifik virkning af parasitten på viral transkription er illustreret i figur 2B. Men kan vi ikke lade eventuelle yderligere effekter af parasitten på viral indrejse eller fusion (decapsidation), eller på post-integration mekanismer, såsom proteinsyntese eller viral partikel samling og spirende. Endvidere er det muligt, at en anden effekt på HIV-1 replikation ville opnås, hvis parasitten blev tilsat enten samtidigt eller efter MDM infektion med viruset. Vores in vitro co-infektion model giver et kraftfuldt værktøj til at udføre detaljerede undersøgelser af HIV-1 / P. falciparum interaktioner i værtscellen. For eksempel er kombinationen af ​​denne eksperimentelle indretning med andre teknikker, såsom kvantitativ real time PCR, som kan målrettes mod og kvantificere specifikke trin i viral retrotransskription og virusgenomet integration i værtscellegenomet, ganske muligt, og forventes at give yderligere insights ind i de mekanismer, der er involveret i co-infektioner. Desuden specifikke assays evaluere tidlige trin af den virale cyklus (viral fusion, decapsidation, post mængdebestemmelse) kan anvendes til dette grundlæggende protokol til yderligere at analysere virkningen på viral replikation. Disse ændringer viser, hvor fleksibel denne protokol om HIV-1 kvantificering og sporing: Selv standard HIV-1 reverse transkriptase kvantificering analyser ved hjælp af tritium-mærkede nukleotider kunne tænkes at erstatte ELISA for HIV-1 p24. Ud over MDM, forventer vi vores system skal kunne tilpasses til andre celletyper relevante for HIV-1-malaria interaktioner, såsom monocytter og dendritiske celler. Det faktum, at MDM er adhærente celler letter manipulation, hvilket tillader nem udvaskning af iRBC, der ikke er taget i, eller som er i kontakt med MDM, uden at fjerne nogen makrofager. En sådan fordel ikke anvendelse til dendritiske celler og monocytter, som dyrkes i suspension, hvilket komplicerer separation af uRBC og fri iRBC med sådanne celler, og vi er i øjeblikket om dette emne. Vores system kan også være nyttigt at undersøge mere komplekse interaktioner, såsom virkningerne af Plasmodium-eksponerede monocyt-afledte celler i HIV-1 virale cyklus i andre immunceller, såsom CD4-positive T-celler i co-kultur eksperimenter. Endelig kan vores protokol være egnet til eksperimenter ser på effekten af P. falciparum iRBCs på HIV-1 reaktivering i PBMC for HIV-1 inficerede individer. Etik erklæring Menneskelig PBMC blev opnået fra blod fra raske donorer, i overensstemmelse med retningslinjerne i Bioethics Committee af Centre Hospitalier de l&#39;Université Laval Research Center. Et skriftligt samtykke blev opnået fra alle bloddonorer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Multicelleregistreringszone </td><td> 350 til 000-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS-endotoksin fri </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Wisent </td><td> 080-150 </td><td> Varme-inaktiveret ved 56 ° C i 30 minutter </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax II </td><td> Gibco </td><td> 11021-037 </td><td> Opløst i RPMI 1640, filtersteriliseres </td></tr><tr><td> Lymphocyte Separation Medium </td><td> Multicelleregistreringszone </td><td> 305-010-CL </td><td></td></tr><tr><td> Hvide luminometer plader </td><td> Promega </td><td> Z3291 </td><td></td></tr><tr><td> CS Macs adskillelse columms </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-041-305 </td><td></td></tr><tr><td> VarioMacs separator </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-090-282 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin-opløsning </td><td> Wisent </td><td> 450-201-EL </td><td></td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td><td></td></tr><tr><td> Celleskraber (25 cm) </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1830 </td><td></td></tr><tr><td> 24-brønds cellekulturplader </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 20 mm dyrkningsskål </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td></td></tr><tr><td> M-CSF </td><td> Genscript </td><td> Z02001 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> Humant serum AB + </td><td> Valley Biomedicinsk </td><td> HP1022 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Wisent </td><td> 311-505-CL </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397 </td><td></td></tr><tr><td> Hypoxanthin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9636 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Luciferase Assay System </td><td> Promega </td><td> E1500 </td><td></td></tr><tr><td> Humane røde blodlegemer </td><td></td><td></td><td> Opnået oprenset fra Chul blodbank. </td></tr></tbody></table>

an in vitro co-infection model to study plasmodium falciparum-hiv-1 interactions in human primary monocyte-derived immune cells

Plasmodium falciparum, det forårsagende middel af den dødbringende form malaria, og human immundefekt virus type-1 (HIV-1) er blandt de vigtigste sundhedsproblemer i hele verden, er ansvarlig for en total på 4 millioner dødsfald årligt 1. På grund af deres omfattende overlap i udviklingslandene regioner, især Afrika syd for Sahara, co-infektioner med malaria og HIV-1 er almindelige, men samspillet mellem de to sygdomme er dårligt forstået. Epidemiologiske rapporter har foreslået, at malariainfektion transient forøger HIV-1 replikation og forøger HIV-1 viral belastning i co-inficerede individer 2,3. Fordi denne viræmi forbliver højt i flere uger efter behandling med malariamidler, kan dette fænomen have en indvirkning på sygdommens progression og transmission. De cellulære immunologiske mekanismer bag disse observationer er kun blevet undersøgt næppe. De få in vitro undersøgelser Investigating indvirkning malaria på HIV-1 har vist, at udsættelse for opløselige malariaantigener kan forøge HIV-1 infektion og reaktivering i immunceller. Disse undersøgelser anvendte helcelleekstrakter af P. falciparum schizont etape parasitter og perifere mononukleære blodceller (PBMC), hvilket gør det svært at dechifrere, som malaria komponent (er) var ansvarlig for de observerede effekter og hvad målet værtscellerne var 4,5. Nyligt arbejde har vist, at eksponering af umodne monocytafledte dendritiske celler til malariaparasitter pigmentet hemozoin forøget evne til at overføre HIV-1 til CD4 + T-celler 6,7, men faldt HIV-1 infektion af makrofager 8. At kaste lys over denne komplekse proces, en systematisk analyse af samspillet mellem malariaparasitten og HIV-1 i forskellige relevante humane primære cellepopulationer er kritisk behov. Adskillige teknikker til undersøgelse af virkningen af ​​HIV-1 på fagocytose af mikroorganismer, og virkningen af ​​sådanne patogener på HIV-1 replikation, er blevet beskrevet. Vi her præsenterer en metode til at undersøge virkningerne af P. falciparum-inficerede erythrocytter på replikationen af HIV-1 i humane primære monocyt-afledte makrofager. Virkningen af parasitten eksponering for HIV-1 transkriptionelle / translationelle begivenheder overvåges ved hjælp af en enkelt cyklus pseudotype virus, hvori en luciferase-reportergen, der er erstattet af env-genet, mens virkningen af mængden af virus frigivet af de inficerede makrofager bestemmes ved måling af HIV-1-capsid-protein p24 ved ELISA i cellesupernatanter.

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells at JoVE.com

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Vi har udviklet en<em&gt; In vitro</em&gt; Malaria-HIV-1 co-infektion model for at undersøge virkningen af<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; På HIV-1 replikativ cyklus i humane primære monocyt-afledte makrofager. Dette alsidige system kan let tilpasses andre primære celletyper modtagelige for HIV-1 infektion.

En<em&gt; In vitro</em&gt; Samtidig infektion model for at studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions i humane primære Monocytafledte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til Studieinformationen Heterogeneity for Human Makrofag Differentiering og polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til måling neutrofiladhæsion til Aktiverede primære humane mikrovaskulære endotelceller under statiske forhold

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til måling immunresponser på malaria i forbindelse med hiv co-infektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation of Human monocytafledte dendritiske celler fra fuldblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menneskelige Colonoid encellelag at studere samspillet mellem patogener, latente og vært intestinale epitel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Højeffektiv generation af antigen-specifikke primære mus cytotoksiske T-celler til funktionel testning i en autoimmun diabetes model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

siRNA elektroporation at Modutere Autophagy i herpes simplex virus type 1-inficerede Monocyte-afledte dendritiske celler

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...