Name: an in vitro co-infection model to study plasmodium falciparum-hiv-1 interactions in human primary monocyte-derived immune cells
Uploaded: 2012-08-15T13:00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research genom en katalysator Co-infektioner och komorbiditeter bidrag. Humana erytrocyter lämnades av centret Hospitalier de l&#39;Université Laval blodbank.

Obs: Experiment med HIV-1 och Plasmodium falciparum måste utföras i rätt skyddsnivå laboratorier (BSL2 för parasiter och BSL3 för HIV-1 och co-infektioner) och särskild försiktighet måste iakttas vid användning av potentiellt smittade blod. 1. Perifera mononukleära blodceller (PBMC) Rening (Baserat på 8 och 9) <ol><li> Starta med färskt humant blod från friska donatorer (500 ml) behandlades med antikoagulantia heparin, citrat, surt citrat dextros eller citratfosfatdextros). Använd endotoxin-fria reagenser vid rening och isolering av PBMC och resten av protokollet. </li><li> Desinficera blodet väskan, inklusive röret, med 70% etanol, kapa röret och försiktigt föra blodet i en T150 kolv. </li><li> Förbered 16 rör med 15 ml Lymfocyter Separation Medium (Ficoll) per 50 ml koniskt rör (se till att Ficoll har nått rumstemperatur).Noggrant skikt 30 ml färskt blod ovanpå. </li><li> Centrifugera vid 400 x g under 30 min vid 20 ° C med avbryter. </li><li> Under centrifugeringen, framställa 8 x 50 ml koniska rör med 25 ml rumstemperatur Hanks balanserade saltlösning (HBSS) per rör. </li><li> Försiktigt över den grumliga cellen ringen i gränssnittet (innehåller PBMC) till 50 ml röret med HBSS (pool 2-celler ringar per rör). Fullborda volymer upp till 50 ml med HBSS. </li><li> Centrifugera vid 150 xg under 15 min vid 20 ° C med pauser på. </li><li> Under centrifugering av den grumliga cellen ringen, samla det gula övre lagret från det Ficoll steg, pool plasma för att fylla upp ett 50 ml koniskt rör. Inaktivera komplement i plasma genom att upphetta 50 ml rör vid 56 ° C under 30 min och centrifugera i 10 min vid 1800 x g. Håll supernatanten (består av utspädd autolog plasma som kan användas som medium tillägg på senare steg). </li><li> Försiktigt avlägsna supernatanten och resuspend cellpelleten från steg 1,7 i 25 ml HBSS och poolen 2 pellets per 50 ml-rör. Snurra med 300 x g under 8 min vid 20 ° C. </li><li> Avlägsna supernatanten försiktigt och återsuspendera pellets i 10 ml HBSS och pool i en 50 ml rör. </li><li> Tag en alikvot genom att utföra trypanblåttuteslutning att bedöma dödligheten och sedan räkna PBMC. </li><li> Hela volymen till 50 ml med HBSS och spinn 10 min vid 300 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i RPMI 1640 vid 5x10 6 celler / ml (en bör få cirka 400-500 x 10 6 PBMC från 500 ml blod). </li></ol> 2. Monocyter makrofager (MDM) Differentiering (Baserat på 8 och 9) <ol><li> Seed ca 1,25 x 10 8 PBMC i 15 cm rätter med RPMI 1640 (25 ml / skål). </li><li> Låt celler vidhäfta under 1-2 h vid 37 ° C med 5% CO2 atmosfär. </li><li> Överföra icke-vidhäftade celler i en ny kolv och tvätta plattan med 15 ml endotoxinfri PBS två gånger (5min, 300 x g). De vidhäftade cellerna är isolerade monocyter. </li><li> För att tillåta nyisolerade monocyter att differentiera till MDM, tillsätt 20 ml RPMI 1640 medium kompletterat med 5% autologt plasma (från steg 1,8). Tillsätt humant rekombinant makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF, 25 ng / ml) och penicillin / streptomycin-lösning (PS, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin). Inkubera under 2 dagar, ändra medium och inkubera 2-3 extra dagar vid 37 ° C i 5% CO2 atmosfär. </li><li> Ta bort gamla medium och tvätta med endotoxinfritt PBS gång, tillsätt PBS försiktigt och aspirera omedelbart. Att lösgöra fullt differentierade MDM behandla celler med ca 7 ml Accutase (Accutase, en kommersiellt tillgänglig blandning av proteaser och kollagenolytisk aktivitet som tillåter lösgörande av celler från plastskål) i 15-20 min vid 37 ° C i en 5% CO 2 atmosfär, rocka försiktigt i mitten tid. </li><li> Lägg 3-5 ml autolog plasma (från steg 1,8) på varje platta (för att skydda cellerna samtidigtskrapning). </li><li> Försiktigt skrapa celler och se till att medium räknas cellerna i alla tider och överföring / pool i en 50 ml rör. </li><li> Skölj-plattor med endotoxinfritt PBS för att återvinna så många celler som möjligt. </li><li> Snurra 5 min vid 200 x g, kasta supernatanten. </li><li> Återsuspendera pelleten i 5 ml MDM odlingsmedium (RPMI 1640 kompletterat med 10% Komplement-inaktiverat fetalt bovint serum (iFBS), PS, 25 mM HEPES) och celler räknas (MDM utbyte vanligen 2-8% av den totala PBMC). Obs: en alikvot av MDM kan vidtas i detta steg för att bedöma renheten cellpopulation med flödescytometri, vanligtvis 99% av hela MDM express CD14. </li><li> Frö 1x10 5 MDM i 600 pl av MDM odlingsmedium per brunn i 24-brunnsplattor. </li><li> Inkubera över natten vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär före infektion. </li></ol> 3. Produktion och kvantifiering av HIV-1 virala förråd <ol><li> Producera virala lager med transfektion kalciumfosfat i HEK293T celler Follovinge protokollet av Fortin et al. 10. </li><li> För att erhålla enkel process virus innehållande luciferas-kodande reportergen, samtransfektion HEK293T-celler med antingen 20 ^ g av NL4.3 Luc + Env - R ^ och 10 ^ g av pHCMV-G, eller 15 ^ g av NL4.3 Luc + Env - R + och 15 pg pJRFL env. Användning 30 ng NL4.3 Luc + Env - R + att generera kontroll glykoprotein-brist virus. För den fullständigt replikativt virus, använda 30 | ig NL4.3Bal env. Vektorerna pHCMV-G och pJRFL env kodar höljesglykoproteinerna av vesikulärt stomatitvirus (VSV-G) och av en CXCR5-tropiska HIV-1 (annan än NL4.3Bal env), respektive. Ytterligare information om de plasmider kan erhållas från 8. Plasmider kan erhållas genom NIH AIDS Research and Reference Program (NIAID, NIH). </li><li> Kvantifiera alla virala förråd med användning av ELISA för HIV-1 p24-kapsidprotein 11Och kontrollera att de smittsamma potential före användning. Vi bedömer att infektiviteten hos våra virusförråd genom användning av TZM-bl indikatorceller 12. </li></ol> 4. Kultur av Plasmodium falciparum Parasiter (Baserat på 13) 4,1 allmänbildning och underhåll av parasiter <ol><li> Bibehålla P. falciparum 3d7 asexuella stadium parasiter i humana erytrocyter (blodgrupp O +) vid en 4% hematokrit i RPMI 1640 (buffrat med 25 mM HEPES och 25 mM NaHCO 3) kompletterat med 0,5% (vikt / volym) Albumax II 25 | ig / ml gentamicin och 370μM Hypoxantin vid 37 ° C i en gasblandning av 1% syre / 5% koldioxid i kväve. </li><li> Parasitemia kan övervakas genom att en tunn utstryk av kulturen och färgning med en 15% Giemsa lösning. </li><li> Alltid ha en oinfekterade röda blodkroppar (uRBC) odlingsskål på samma villkor som parasiter att använda som en kontroll. För att erhålla sent stadium Parasites (trofozoiter / tidig schizonter), synkronisera de parasiter enligt följande: </li></ol> 4,2 Parasit synkronisering <ol><li> På morgonen skörda parasiten kulturen, spinn 5 min vid 300 xg och kasta supernatanten. </li><li> Återsuspendera pelleten i 5 packade cellvolymer med 5% (vikt / volym) D-sorbitol och inkubera 5 min vid 37 ° C. </li><li> Spin 5 min vid 300 x g, kassera supernatanten, återsuspendera pelleten i 30 ml odlingsmedium och sätta tillbaka i inkubator. </li><li> Ungefär 8 timmar senare, upprepar du steg 4.2.1 till 4.2.3 för att få tätt synkroniserade parasiter. Sent skede parasiter (trofozoiter / tidig schizonter) kan sedan skördas följande morgon för att utföra experimentet. Före rening, utföra Giemsa färgning för att bekräfta dess livscykel. </li></ol> 4.3 Plasmodium falciparum-infekterade röda blodkroppar (iRBC) Rening <ol><li> Sterilisera VarioMacs separatorn (stativ och magnet) med 70% etanol och pspetsar den under biologiska huven. </li><li> Fixera trevägskran till CS kolonnbotten. </li><li> Klipp änden av nålen plastskyddet med Miltenyi speciella kniven och fäst nålen kranen botten. </li><li> Låsa kolonnen in i magneten noggrant. </li><li> Avlägsna alla luftbubblor i kolonnen genom att långsamt injicering av 10 ml MDM odlingsmedium med kitet-bifogade spruta skruvas på den vänstra sidan av avstängningsventilen. </li><li> Tvätta kolonnen med ~ 20 ml MDM odlingsmedium. </li><li> Skörd RBC från odlingsplattan, tvätta en gång med 10 ml MDM-medium (300 xg, 5 minuter) och återsuspendera RBC pelleten i 12 ml MDM odlingsmedium. Tillsätt långsamt till kolonnen och låta suspensionen strömmar genom (endast infekterade röda blodkroppar innehållande parasiter i trofozoit eller schizont steg kommer att kvarhållas av det magnetiska fältet på grund av närvaron av hemozoin kristaller). </li><li> Tvätta en gång med 20 ml medium och stoppa vätskeflöde när det når den vita skivan på toppen av kolonnen. </li><li>Ta bort kolumnen från magneten och eluera iRBC i ett rent sterilt rör med 12 ml MDM odlingsmedium. </li><li> Utstryk en alikvot av den återvunna iRBC och utför Giemsa-färgning för att bekräfta dess livscykel. </li><li> Räkna utvanns iRBC med användning av en hemocytometer (isolerad RBC är 100% iRBC). </li><li> Pelletera celler (300 xg, 5 minuter), kasta supernatanten och behandla cellerna med 500 | il färskt AB + humanserum (opsonisering steg 14). </li><li> Inkubera under 30 min vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär. </li><li> Tvätta en gång med 10 ml MDM odlingsmedium (300 x g, 5 min) och återsuspendera iRBC till önskad koncentration. Vanligtvis ger en 10% parasitemia 15 cm odlingsskål ungefär ~ 0,5-1x10 8 ordentligt synkroniserade iRBC. </li></ol> 5. Exponering av MDM för Plasmodium falciparum <ol><li> Att exponera MDM för uRBC eller iRBC, måste cellerna återsuspenderas i MDM odlingsmedium för att erhålla ett förhållande av uRBC / iRBC: MDM av 75:1. I tidigarepreparerade 24-brunnars plattor innehållande MDM, tillsätt lämplig RBC-suspension volym i varje brunn. Utföra alla experiment i triplikat. </li><li> Inkubera samkulturer under 4 h vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär. </li><li> Tvätta cellerna med 600 | il av endotoxinfri PBS 3 gånger, tillsätt försiktigt PBS och aspirera omedelbart. </li><li> För att lysera de kvarvarande RBC, tvätta brunnarna genom tillsats av 200 | il iskall steril vatten under 20 sekunder och aspirera. </li><li> Tillsätt 600 pl medium MDM kultur och inkubera 24 timmar vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär. </li></ol> 6. Infektion av MDM med en helt Replikativ HIV-1 <ol><li> För att bedöma effekten av P. falciparum på HIV-1-replikering i MDM, lägga, enligt systemet som beskrivs i figur 1A, 10 ng p24 (i 300 pl MDM media) i NL4.3Bal env virus i lämpliga brunnar, bara lägga MDM medium i kontrollbrunnar . </li><li> Inkubera 2 timmar vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär. </li><li> Tvätta cellerna med endotoxinfri PBS 3 gånger, tillsätt försiktigt PBS och aspirera omedelbart. Tillsätt 600 pl färsk MDM-medium per brunn. </li><li> Inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär. </li><li> På dagarna 3, 6, 9 och 12 efter starten av virusinfektion, skörd 200 pl av varje supernatant, lägga 200 pl färskt MDM-medium därefter. Hålla de skördade supernatanterna vid -20 ° C för kvantifiering av den stora HIV-1 p24-kapsid-protein genom ELISA efter Fortin et al. 10. </li></ol> 7. Infektion av MDM med enkel cykel Virus som kodar luciferas <ol><li> I syfte att bestämma parasitens inverkan på HIV-1-genexpression i MDM, lägga till, enligt schemat som anges i figur 1B, 10 ng p24 (i 300 pl av MDM-medium) av antingen NL4.3 Luc + Env - R + ( VSV-G-), NL4.3 Luc + env - R + (JRFL env) eller NL4.3 Luc +ENV - R + virus i motsvarande brunnar. </li><li> Inkubera 2 timmar vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär. </li><li> Tvätta cellerna med 600 | il av endotoxinfri PBS 3 gånger, tillsätt försiktigt PBS och aspirera omedelbart. Tillsätt 600 pl färsk MDM-medium per brunn. </li><li> Inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär. </li><li> Ta bort mediet 72 timmar efter infektion och tillsätt 200 pl lyseringsbuffert 1X (medföljer luciferasanalysen kit). Låta cellerna lyserar i rumstemperatur med försiktig skakning. Förvara vid -20 ° C. </li><li> Tina plattan och överföra 40 | il av lysatet till en 96-brunnars platta luminometer, tillsätt 100 | il luciferas-substrat (medföljer luciferasanalysen kitet) och mäta luciferas (eldflugeluciferas)-aktivitet i en luminometer genom att följa tillverkarens instruktioner. </li></ol> 8. Representativa resultat Med vår samtidig infektion modell visar vi att exposure av P. falciparum att MDM minskar deras känslighet för HIV-1-infektion. I själva verket en signifikant minskning (p &lt;0,05; 2 vägs ANOVA, dag 12) i ​​frisättningen av virala partiklar, såsom uppmäts genom HIV-1 p24-kapsidproteinet i supernatanten, observeras i MDM förbehandlats med parasiter (figur 2A). Denna observation bekräftades i celler infekterade med virus som kodar en luciferas-reportergenen. MDM infektion med sådana virus som hyser antingen exogent VSV-G-eller HIV-1 glykoproteiner leder till signifikant (p &lt;0,05, Students t-test) minus luciferas produktion i celler exponerade för P. falciparum (figur 2B). Det är anmärkningsvärt att VSV-G-pseudotypade virus gav mycket större luciferasaktivitet än deras motsvarigheter JRFLenv, vilket är beroende på den större infektionseffektivitet av VSV-G-pseudotypade partiklar 15. Med tanke på att parasiten exponering för MDM effekter båda typerna av virus, tyder detta på att den påverkar en del steg i viral gen expression (figur 2B). Det är också viktigt att nämna att cellviabiliteten inte påverkades av MDM exponering för iRBC (data visas ej), vilket indikerar att inhibition observerade är specifik och inte beror på celldöd. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig1.jpg" /> Figur 1. A) Plate system för MDM infektion med en helt replikativt virus Mock. Oinfekterade celler. uRBC: celler utsatta för oinfekterade röda blodkroppar. iRBC: celler utsatta för Plasmodium falciparum-infekterade röda blodkroppar. Bal: celler infekterade med NL4.3Bal env Bal / uRBC:. Celler exponerade för uRBC och infekterades med NL4.3Bal env Bal / iRBC: a. celler exponerade för iRBC och infekterade med NL4.3Bal env B) platta system för MDM-infektion med enda cykel luciferas-kodning virus Mock. oinfekterade celler. uRBC: celler utsatta för oinfekterade röda blodkroppar. iRBC: celler utsatta för Plasmodium falciparum-infected röda blodkroppar. Δenv: celler infekterade med NL4.3 Luc + Env - R + JRFL:. Celler infekterade med NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env). VSV-G: celler infekterade med NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G) Δenv / uRBC:.. celler exponerades för uRBC och infekterades med NL4.3 Luc + Env-R + Δenv / iRBC: celler utsatta för iRBC och infekterade med NL4.3 Luc + Env - R + JRFL / uRBC: celler som utsätts för uRBC och infekterade med NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env).. JRFL / iRBC: celler som utsätts för iRBC och infekterade med NL4.3 Luc + Env - R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: celler utsatta för uRBC och infekterades med NL4.3 Luc + Env - R + (VSV-G) vsv-g/iRBC. celler exponerade för iRBC och infekterades med NL4.3 Luc + Env - R ^ (VSV-G). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/&gt; Figur 2. . A) Effekt av Plasmodium falciparum på HIV-1 virala produktionen i MDM-MDM exponerades för uRBC eller iRBC vid ett förhållande 75:1 (uRBC / iRBC: MDM) under 4 timmar och tvättades noggrant. Cellerna infekterades med 10 ng av NL4.3Bal env p24 under 2 timmar. Övervakades genom ELISA med avseende på HIV-1 p24 i cellfria supernatanten vid olika tidpunkter efter initial virusinfektion Viral produktion. Ett representativt experiment visas B) Effekt av Plasmodium falciparum på HIV-1 virala transkription i MDM infekterades med uRBC eller iRBC vid ett förhållande 75:1 (uRBC / iRBC MDM:.. MDM). Cellerna infekterades sedan med 10 ng av p24 av enstaka cykel-virus (antingen NL4.3 Luc + Env - R ^, NL4.3 Luc + env - R + (JRFL env) eller NL4.3 Luc + Env - R + (VSV- g)). Luciferasuttryck utvärderades i cellysat 72 h efter initial virusinfektion. Ett representativt experiment visas.

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Malaria Report. , (2005).</li><li>Kublin, J. G., Patnaik, P., Jere, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Plasmodium+falciparum+malaria+on+concentration+of+HIV-1-RNA+in+the+blood+of+adults+in+rural+Malawi:+a+prospective+cohort+study.">Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study.</a> Lancet. 365, 233-240 (2005).</li><li>Cuadros, D. F., Branscum, A. J., Crowley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-malaria+co-infection:+effects+of+malaria+on+the+prevalence+of+HIV+in+East+sub-Saharan+Africa.">HIV-malaria co-infection: effects of malaria on the prevalence of HIV in East sub-Saharan Africa.</a> Int. J. Epidemiol. 40, 931-939 (2011).</li><li>Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+antigen-induced+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+is+mediated+through+induction+of+tumor+necrosis+factor-alpha.">Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha.</a> J. Infect. Dis. 177, 437-445 (1998).</li><li>Froebel, K., Howard, W., Schafer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+malaria+antigens+renders+mononuclear+cells+susceptible+to+HIV+infection+and+re-activates+replication+of+endogenous+HIV+in+cells+from+HIV-infected+adults.">Activation by malaria antigens renders mononuclear cells susceptible to HIV infection and re-activates replication of endogenous HIV in cells from HIV-infected adults.</a> Parasite Immunol. 26, 213-217 (2004).</li><li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+derived+from+hemozoin-loaded+monocytes+display+a+partial+maturation+phenotype+that+promotes+HIV-1+trans-infection+of+CD4++T+cells+and+virus+replication.">Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication.</a> J. Immunol. 184, 2899-2907 (2010).</li><li>Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+hemozoin+modulates+susceptibility+of+immature+monocyte-derived+dendritic+cells+to+HIV-1+infection+by+inducing+a+mature-like+phenotype.">Malaria hemozoin modulates susceptibility of immature monocyte-derived dendritic cells to HIV-1 infection by inducing a mature-like phenotype.</a> Cell Microbiol. 12, 615-625 (2010).</li><li>Diou, J., Gauthier, S., Tardif, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+the+malaria+pigment+hemozoin+renders+human+macrophages+less+permissive+to+HIV-1+infection.">Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages less permissive to HIV-1 infection.</a> Virology. 395, 56-66 (2009).</li><li>Davies, J. Q., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+human+macrophages.">Isolation and culture of human macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 290, 105-116 (2005).</li><li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity.">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li><li>Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+host+ICAM-1+in+laboratory+and+clinical+strains+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+increases+virus+infectivity+and+CD4(+)-T-cell+depletion+in+human+lymphoid+tissue,+a+major+site+of+replication+in+vivo.">Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo.</a> J. Virol. 76, 1004-1014 (2002).</li><li>Wei, X., Decker, J. M., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+patients+receiving+fusion+inhibitor+(T-20)+monotherapy.">Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193, 673-675 (1976).</li><li>Turrini, F., Ginsburg, H., Bussolino, F., Pescarmona, G. P., Serra, M. V., Arese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+human+red+blood+cells+by+human+monocytes:+involvement+of+immune+and+nonimmune+determinants+and+dependence+on+parasite+developmental+stage.">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage.</a> Blood. 80, 801-808 (1992).</li><li>Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+CD34++cells+with+a+human+immunodeficiency+virus+type+1-based+retroviral+vector+pseudotyped+with+vesicular+stomatitis+virus+envelope+glycoprotein+G.">High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G.</a> J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).</li><li>Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+infantum+enhances+human+immunodeficiency+virus+type-1+replication+in+primary+human+macrophages+through+a+complex+cytokine+network.">Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network.</a> Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Vi har illustrerat här två olika metoder för att analysera effekterna av malariaparasiten på HIV-1 virus cykeln, dvs genom att analysera antingen viral genuttryck eller avkomma virus produktion och replikering i monocythärledda makrofager. Liknande tillvägagångssätt har använts för andra HIV-1-parasit sam-infektioner 16. Dessa nya data är ett steg framåt i utredningen av malaria-HIV-1 co-infektioner. . I själva verket Diou et al 8 studerade effekten av hemozoin, inte levande parasiter, på HIV-1-replikering, i överensstämmelse med våra resultat, konstaterade de att hemozoin själv var tillräcklig för att hämma viral produktion av MDM, och inte MDMs. Använda den beskrivna experimentella layout, observerade vi att P. falciparum utövar en tydlig negativ effekt på HIV-1 replikativa cykel i makrofager: en signifikant hämning av viral produktion observeras i makrofager i förväg utsatta för parasiter (Figure 2A) och en specifik inverkan parasit på viral transkription illustreras i figur 2B. Men vi kan inte lämna ut några ytterligare effekter av parasiten på viralt inträde eller fusion (decapsidation), eller på post-integration mekanismer, såsom protein syntes eller viral partikel montering och spirande. Dessutom är det möjligt att en annan effekt på HIV-1-replikering skulle erhållas om parasiten lades antingen vid samma tidpunkt eller efter MDM infektion med viruset. Vår vitro-infektion modell ger ett kraftfullt verktyg för att utföra detaljerade undersökningar av HIV-1 / P. falciparum interaktioner i värdcellen. Till exempel en kombination av detta experimentella layout med andra tekniker, såsom kvantitativa realtid PCR, som kan rikta och kvantifiera specifika steg i viral retrotranskription och virala genomet integration i värdcellens genom, är fullt möjligt och bör ge ytterligare insights i de mekanismer som är inblandade i co-infektioner. Dessutom att vissa analyser utvärdera tidiga stegen av den virala cykeln (viral fusion, decapsidation, inträde kvantifiering) kan tillämpas på denna grundläggande protokollet för att ytterligare analysera effekten på virusreplikation. Dessa ändringar visar hur flexibelt detta protokoll är om HIV-1 kvantifiering och detektion: faktiskt även vanliga HIV-1 omvänt transkriptas kvantifiering analyser använder tritium-märkt nukleotider kan tänkas ersätta ELISA för HIV-1 p24. Förutom MDM, räknar vi med vårt system för att kunna anpassas till andra celltyper som är relevanta för HIV-1-malaria interaktioner, såsom monocyter och dendritiska celler. Det faktum att MDM är vidhäftande cellerna underlättar manipulation, vilket möjliggör enkel att tvätta av iRBC som inte har tagits in, eller som kommer i kontakt med MDM, utan att eliminera några makrofager. En sådan fördel skulle inte tillämpas på dendritiska celler och monocyter, vilka odlas i suspension, vilket komplicerar sigparation av uRBC och fria iRBC med sådana celler och som vi nu behandlar denna fråga. Vårt system skulle också vara användbara för att studera mer komplexa interaktioner såsom effekterna av Plasmodium-exponerade monocyt-härledda celler på HIV-1 virala cykeln i andra immunceller såsom CD4-positiva T-celler i samodling experiment. Slutligen kan vi protokoll vara lämplig för experiment tittar på effekten av P. falciparum iRBCs på HIV-1 reaktivering i PBMC för HIV-1 infekterade individer. Etik meddelandet Humana PBMC erhållna från blod av friska givare, i enlighet med riktlinjerna från kommittén bioetik för centrumet Hospitalier de l&#39;Université Laval Research Center. Ett skriftligt godkännande erhölls från alla blodgivare.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Multicell </td><td> 350-000-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS-endotoxinfri </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> BISONOXE </td><td> 080-150 </td><td> Värmeinaktiveras vid 56 ° C under 30 minuter </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax II </td><td> Gibco </td><td> 11021-037 </td><td> Löst i RPMI 1640, filtersteriliserades </td></tr><tr><td> Lymfocytseparationsmedium </td><td> Multicell </td><td> 305-010-CL </td><td></td></tr><tr><td> Vita luminometer plattor </td><td> Promega </td><td> Z3291 </td><td></td></tr><tr><td> CS Mac separering columms </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-041-305 </td><td></td></tr><tr><td> VarioMacs separatorn </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-090-282 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin-lösning </td><td> BISONOXE </td><td> 450-201-EL </td><td></td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td><td></td></tr><tr><td> Cellskrapa (25 cm) </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1830 </td><td></td></tr><tr><td> 24-brunnars Cellodlingsplattorna </td><td> BD Falcon </td><td> 353.047 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 20 mm odlingsskål </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td></td></tr><tr><td> M-CSF </td><td> Genscript </td><td> Z02001 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> Humant serum AB + </td><td> Dal Biomedicinsk </td><td> HP1022 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> BISONOXE </td><td> 311-505-CL </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397 </td><td></td></tr><tr><td> Hypoxantin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9636 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCOs 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Luciferase Assay System </td><td> Promega </td><td> E1500 </td><td></td></tr><tr><td> Humana röda blodkroppar </td><td></td><td></td><td> Erhållna renade från Chul blodbank. </td></tr></tbody></table>

an in vitro co-infection model to study plasmodium falciparum-hiv-1 interactions in human primary monocyte-derived immune cells

Plasmodium falciparum, vilka smittämnen av dödligaste formen av malaria, och humant immunbristvirus typ-1 (HIV-1) är bland de viktigaste hälsoproblemen i världen, är ansvarig för sammanlagt 4 miljoner dödsfall årligen 1. På grund av sina omfattande överlappning i utvecklingsregioner, särskilt Afrika söder om Sahara, co-infektioner med malaria och HIV-1 är vanliga, men samspelet mellan de båda sjukdomarna är dåligt förstådd. Epidemiologiska rapporter har antytt att malariainfektion övergående ökar HIV-1-replikation och ökar HIV-1 virusmängd i samarbete infekterade individer 2,3. Eftersom denna viremi förblir hög i flera veckor efter behandling med malariamedel, kan detta fenomen ha en inverkan på sjukdomsutveckling och överföring. De cellulära immunologiska mekanismerna bakom dessa observationer har endast studerats knappast. De få in vitro-studier Investigrustningen inverkan av malaria på HIV-1 har visat att exponering för lösliga malariaantigener kan öka HIV-1-infektion och reaktivering i immunceller. Emellertid används dessa studier helcellextrakt av P. falciparum schizont scen parasiter och perifera mononukleära celler (PBMC), vilket gör det svårt att tolka vilka malaria komponent (er) var ansvarig för de observerade effekterna och vad målet värdceller 4,5. Nytt arbete har visat att exponering av omogna monocythärledda dendritiska celler till malaria pigmentet hemozoin ökar sin förmåga att överföra HIV-1 till CD4 + T-celler 6,7, men att den minskade HIV-1-infektion av makrofager 8. Att belysa denna komplexa process, en systematisk analys av samspelet mellan malariaparasiten och HIV-1 i olika relevanta humana primära cell populationer kritiskt behövs. Flera tekniker för att undersöka effekten av HIV-1 på fagocytos av mikroorganismer och effekten av sådana patogener på HIV-1-replikation har beskrivits. Vi presenterar här en metod för att undersöka effekterna av P. falciparum-infekterade erytrocyter på replikation av HIV-1 i humana primära monocythärledda makrofager. Effekten av parasiten exponering för HIV-1-transkriptionella / translationella händelser övervakas genom användning av enkel process pseudotypade virus, i vilka en luciferasreportergen har ersatts av env-genen, medan effekten på den mängd virus frisätts av de infekterade makrofager bestämdes genom mätning av HIV-1-kapsidprotein p24 genom ELISA i cellsupernatanter.

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells at JoVE.com

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Vi har utvecklat ett<em&gt; In vitro</em&gt; Malaria-HIV-1-infektion modell för att studera effekterna av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; I HIV-1-replikativa cykeln i humana primära monocythärledda makrofager. Denna mångsidiga system kan enkelt anpassas till andra primära celltyper mottagliga för HIV-1-infektion.

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infektion modell för att studera<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions in Human primära monocyt-härledda Immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Ett<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera skillnader mellan de mänskliga makrofagdifferentiering och polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell för mätning av immunsvar mot malaria som led av HIV-infektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från helblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Mänskliga Colonoid enskiktslager att studera interaktioner mellan patogener, förknippas och värd Intestinal epitel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Högeffektiv generering av antigen-specifika primära mus cytotoxiska T-celler för funktionell testning i en autoimmun diabetes modell

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

siRNA elektroporation att modulera autofagi i herpes simplex virus typ 1-infekterade Monocyte-derived dendritiska celler

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...