Name: quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Pittsburgh Foundation en de National Institutes of Health (NIH) [GM087798, CA148629, ES019498] om RWS. Ondersteuning voor de UPCI Lentivirale faciliteit werd verstrekt aan RWS door de Cancer Support Grant van de National Institutes of Health [P30 CA047904]. Ook is steun verleend door de Universiteit van Pittsburgh Afdeling Farmacologie &amp; Chemical Biology naar de DS. Ook is steun verleend door de ESTRO aan CV.

1. Molecular Beacon Ontwerp 1.1 Het ontwerpen en bestellen van uw moleculair beacon Het ontwerp van uw moleculair beacon moet rekening houden met het volgende: <ol class="lalpha"><li> We hebben goede resultaten met 43-mer DNA-oligonucleotiden. De GC-inhoud moet&gt; 32% zijn. Uitsluiten G base aan het 5 &#39;uiteinde. </li><li> Aanvraag 6 FAM (6 carboxyfluoresceïne) conjugatie aan het 5 &#39;uiteinde en Dabcyl als 3&#39; modificatie. </li><li> De positie van de la...

<ol>
	<li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide.">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li><li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide.">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids.">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li><li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes.">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li><li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O(+6)-methylguanine+DNA+methyltransferase,+methylpurine+DNA+glycosylase,+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities:+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase.">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li><li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons.">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li><li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon.">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li><li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time.">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase.">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li><li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity.">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li><li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity.">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li><li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells.">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li><li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon.">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li><li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells.">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li><li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities.">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li></ol>

Er zijn meer dan 600 citaten gebruik van de term &#39;moleculaire baken&#39; voor het detecteren en kwantificeren van tal van moleculen en enzymatische activiteiten, waaronder helicase activiteit 6, DNA-polymerase-activiteit 7,8, DNA-ligase activiteit 9, telomerase activiteit 10, DNA photolyase activiteit 11 en DNA / RNA hybriden 12, onder vele anderen. Naast het gebruik van moleculaire bakens voor het meten van het DNA bovengenoemde activiteiten, hebben ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Kalium Chloride </td><td> Visser </td><td> P217-500 </td><td> Moleculair-biologische kwaliteit </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Visser </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Visser </td><td> BP229-1 </td><td> Moleculair-biologische kwaliteit </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Visser </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-oplossing </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-zout </td><td> Sigma </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Kalium Hydroxide </td><td> Sigma </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μM filter </td&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer Dialyse Producten </td><td> Doorboren </td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Injectiespuit </td><td> Visser </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Naald </td><td> Visser </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml PCR </td><td> Visser </td><td> 05-408-129 </td><td> Zwart </td></tr><tr><td> 15 ml Falcon buizen </td><td> Visser </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBuster Protein Extraction Kit </td><td> Calbiochem </td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Molecular Beacons </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRad eiwit assay kleurstof remiddel concentraat </td><td> BioRad </td><td> Cat # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons

We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in celkernen lysaten met behulp van base excisie reparatie (BER) moleculaire bakens. Het substraat (baken) bestaat uit een deoxyoligonucleotide met een base laesie met een 6-carboxyfluoresceïne (6 FAM) groep geconjugeerd aan het 5&#39;-uiteinde en een Dabcyl groep geconjugeerd aan het 3&#39;-uiteinde van het oligonucleotide. De BER moleculaire baken is 43 basen lang en de sequentie is ontworpen om de vorming van een lusstructuur stam-met 13 nucleotiden in de lus en 15 basenparen in de steel 1,2 bevorderen. Wanneer gevouwen deze configuratie de 6-FAM groep gedoofd door Dabcyl een niet fluorescerende wijze via Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4. Het letsel is zodanig dat na base laesie verwijderen en onderdeel splitsing de resterende 5 base oligonucleotide met de 6-FAM groep vrijkomt van de steel. Laat eennd onthechting van de quencher (Dabcyl) resulteert in een toename van de fluorescentie die evenredig is aan het niveau van DNA-herstel. Door het verzamelen van meerdere leest van de fluorescentie waarden, real-time beoordeling van de BER-activiteit is mogelijk. Het gebruik van standaard kwantitatieve real-time PCR-instrumenten maakt de gelijktijdige analyse van een groot aantal monsters. Het ontwerp van deze BER moleculaire bakens, met een enkele base laesie, vatbaar is voor kinetische analyses, BER kwantificering en validatie-remmer en is aangepast voor de kwantificering van DNA-reparatie-activiteit in het weefsel en tumor cellysaten of met gezuiverde eiwitten. De analyse van de groepsvrijstellingsverordening activiteit in de tumor lysaten of weefsel zuigt het gebruik van deze moleculaire beacons van toepassing kunnen zijn om functionele biomarker-metingen. Verder is de analyse van de BER activiteit met gezuiverde eiwitten met behulp van deze kwantitatieve test voor een snelle, high-throughput methode voor de identificatie en validatie van de BER-remmers.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons at JoVE.com

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in cel nucleaire lysaten. De test levert de tarieven van de DNA-reparatie-activiteit vatbaar zijn voor kinetische analyse en is aanpasbaar voor de kwantificering van DNA Repair activiteit in weefsel en tumor lysaten of met gezuiverde eiwitten.

Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Kwantitatieve real-time PCR met behulp van de Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Analyse van genexpressie in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Met behulp van kwantitatieve Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Profilering van de Pre-micro-RNA&#39;s en microRNA&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Toepassing van MassSQUIRM voor kwantitatieve metingen van Lysine demethylase activiteit

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Een kwantitatieve analyse Fitness Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analyse van Metabool profiel in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Muis Intestinale Crypt organoïde Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...