Name: quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00
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Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione Pittsburgh e il National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] per RWS. Il supporto per lo strumento UPCI lentivirale è stata fornita RWS mediante la concessione di supporto Cancer Center dal National Institutes of Health [P30 CA047904]. Il sostegno è stato fornito anche dalla University of Pittsburgh Dipartimento di Farmacologia &amp; Chemical Biology al DS. Il sostegno è stato fornito anche da ESTRO a CV.

1. Beacon Progettazione Molecolare 1,1 Progettazione e ordinare il vostro segnale molecolare Il design del faro molecolare deve considerare quanto segue: <ol class="lalpha"><li> Abbiamo buoni risultati con il 43-mer oligonucleotidi di DNA. Il contenuto di GC deve essere&gt; 32%. Escludere una base di G al 5 &#39;. </li><li> Richiesta 6-FAM (6-carbossifluoresceina) coniugazione sulla estremità 5 &#39;e DABCYL come 3&#39; modifica. </li><li> La posizione della lesi...

<ol>
	<li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide.">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li><li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide.">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids.">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li><li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes.">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li><li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O(+6)-methylguanine+DNA+methyltransferase,+methylpurine+DNA+glycosylase,+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities:+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase.">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li><li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons.">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li><li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon.">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li><li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time.">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase.">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li><li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity.">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li><li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity.">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li><li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells.">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li><li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon.">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li><li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells.">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li><li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities.">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li></ol>

Ci sono più di 600 citazioni usando &#39;faro molecolare&#39; il termine per rilevare e quantificare molecole di numerose attività enzimatiche, inclusa l&#39;attività elicasi 6, attività di DNA polimerasi 7,8, l&#39;attività del DNA ligasi 9, l&#39;attività della telomerasi 10, l&#39;attività del DNA fotoliasi 11 e DNA / RNA ibridi 12, tra molti altri. Oltre all&#39;uso di segnali molecolari per la misurazione delle attività di riparazione del DNA...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> Pescatore </td><td> P217-500 </td><td> Grade molecolare </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pescatore </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescatore </td><td> BP229-1 </td><td> Grade molecolare </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Pescatore </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Salt </td><td> Sigma </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Idrossido di potassio </td><td> Sigma </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μM filtro </td&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer dialisi Prodotti </td><td> Perforare </td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Siringa </td><td> Pescatore </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Ago </td><td> Pescatore </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuga 1,5 ml Tubes </td><td> Pescatore </td><td> 05-408-129 </td><td> Nero </td></tr><tr><td> Falcon 15 ml Tubes </td><td> Pescatore </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBuster Protein Extraction Kit </td><td> Calbiochem </td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Molecular Beacons </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRad Protein test dye reagente di concentrato </td><td> BioRad </td><td> Cat # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons

Noi descriviamo un metodo per la determinazione quantitativa, misurazione in tempo reale di DNA glicosilasi e attività di endonucleasi di AP in lisati cellulari nucleari di base utilizzando escissione riparazione (BER) segnali molecolari. Il substrato (beacon) è costituito da un deoxyoligonucleotide contenente una singola lesione base con un 6-carbossifluoresceina (6-FAM) porzione coniugata alla estremità 5 &#39;e una frazione DABCYL coniugato all&#39;estremità 3&#39; dell&#39;oligonucleotide. Il faro BER molecolare è 43 basi di lunghezza e la sequenza è progettato per favorire la formazione di una forcina struttura con 13 nucleotidi nel ciclo e 15 coppie di basi in 1,2 stelo. Quando ripiegato in questa configurazione il 6-FAM frazione viene bloccata mediante DABCYL in un modo non fluorescente tramite trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) 3,4. La lesione è posizionato in modo tale che in seguito alla rimozione lesione base e scissione filamento il restante 5 oligonucleotide base contenente il 6-FAM frazione viene rilasciato dallo stelo. Rilasciare undistacco dalle nd (DABCYL) risultati quencher in un aumento di fluorescenza che è proporzionale al livello di riparazione del DNA. Con la raccolta di più letture dei valori di fluorescenza, valutazione in tempo reale dell&#39;attività BER è possibile. L&#39;impiego di standard quantitativa PCR in tempo reale strumenti consente l&#39;analisi simultanea di numerosi campioni. La progettazione di questi fari BER molecolari, con una lesione singola base, è suscettibile di analisi cinetica, la quantificazione BER e convalida inibitore ed è adattabile per la quantificazione dell&#39;attività riparazione del DNA in tessuto e lisati cellulari tumorali o con proteine ​​purificate. L&#39;analisi dell&#39;attività BER in lisati tumorali o tessuto aspira utilizzando questi segnali molecolari può essere applicabile a misurazioni biomarker funzionali. Inoltre, l&#39;analisi dell&#39;attività BER con proteine ​​purificate utilizzando questo saggio quantitativo fornisce una rapida, ad alta capacità metodo per la scoperta e la convalida di inibitori BER.

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Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Noi descriviamo un metodo per la determinazione quantitativa, misurazione in tempo reale di DNA glicosilasi e attività di endonucleasi di AP in lisati cellulari nucleari. Il test produce tassi di attività DNA Repair suscettibili di analisi cinetica ed è adattabile per la quantificazione delle attività di riparazione del DNA nei tessuti e lisati tumorali o con le proteine ​​purificate.

Quantitativa, in tempo reale Analisi dell&#39;attività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

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