Name: quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00
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RWS이 작품은 피츠버그 재단과 국립 연구소 건강 (NIH) [; CA148629 ES019498 GM087798]에서 교부금에 의해 지원되었다. UPCI Lentiviral 시설에 대한 지원은 국립 보건원에서 암 센터 지원 그랜트에 의해 RWS에게 제공한 [P30 CA047904]. 지원은 또한 피츠버그 대학 약리학 계열 및 DS에 대한 화학 생물학에 의해 제공되었다. 지원은 또한 이력서에 ESTRO에 의해 제공되었다.

1. 분자 표지 디자인 1.1 설계 및 분자 신호를 주문 귀하의 분자 비콘의 디자인은 다음 사항을 고려해야합니다 : <ol class="lalpha"><li> 우리는 43-메르의의 DNA oligonucleotides와 함께 좋은 결과를 가지고. GC 함량이&gt; 32 %가됩니다. 5 &#39;끝에 G 기지를 제외합니다. </li><li> 요청 6 식구들 (6 Carboxyfluorescein) 5 &#39;끝 그리고 3 등 Dabcyl&#39;수정에 활용. </li><li> 병변의 위치...

<ol>
	<li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide.">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li><li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide.">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li><li>Clegg, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O(+6)-methylguanine+DNA+methyltransferase,+methylpurine+DNA+glycosylase,+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities:+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase.">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li><li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons.">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li><li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon.">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li><li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time.">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. 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T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity.">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li><li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells.">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li><li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon.">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li><li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells.">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li><li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities.">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li></ol>

수많은 분자와 helicase 활동 6의 DNA 중합 효소 활동 7,8, DNA ligase 활동 9, telomerase 활동 10, DNA photolyase 활동 11 DNA를 /을 포함하여 효소 활동을 감지하고 quantifying에 대한 용어는 &#39;분자 비컨&#39;를 사용하여 600 인용 이상있다 많은 사람 중에서 하이브리드 12, RNA. 위에 나열된 DNA의 복구 활동의 측정을위한 분자 비콘의 사용 이외에, 우리와 다른 BER 활동 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> 어부 </td><td> P217-500 </td><td> 분자 학년 </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 어부 </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 어부 </td><td> BP229-1 </td><td> 분자 학년 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 어부 </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 15,630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-소금 </td><td> 시그마 </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> 수산화 칼륨 </td><td> 시그마 </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μM 필터 </tD&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드-A-Lyzer 투석 제품 </td><td> 찌르다 </td><td> 66,373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> 어부 </td><td> 309,659 </td><td></td></tr><tr><td> 바늘 </td><td> 어부 </td><td> 305,196 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ML의 Microcentrifuge 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 05-408-129 </td><td> 검정 </td></tr><tr><td> 15 ML 팔콘 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 352,097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBus​​ter 단백질 추출 키트 </td><td> Calbiochem </td><td> 71,183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14,190 </td><td></td></tr><tr><td> 분자 비콘 </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRad 단백질 분석 염료 재에이전트 농축 </td><td> BioRad </td><td> 고양이 # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons

우리는 기본 절단 수리 (BER) 분자 비콘을 사용하여 DNA를 glycosylase 및 세포 핵 lysates의 에이피 endonuclease 활동의 양적, 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 기판 (비콘)은 6 Carboxyfluorescein (6 식구들) 5&#39;end과 oligonucleotide의 3 &#39;끝까지 복합 Dabcyl 잔기에 복합 잔기와 하나의 기본 병변을 포함 deoxyoligonucleotide 구성되어 있습니다. BER 분자 신호의 길이는 43 기지이며, 순서는 줄기 1,2의 루프와 15 기본 쌍 13 세포핵과 줄기 루프 구조의 형성을 촉진하도록 설계되었습니다. 이 구성에 접혀 때 6 식구들 잔기는 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 3,4 통해 비 형광등 방식으로 Dabcyl에 의해 침묵하고 있습니다. 병변은 6 식구들 잔기를 포함하는 나머지 다섯베이스 oligonucleotide는 줄기에서 발표되는 등 그 다음의 기본 병변 제거 및 스트랜드 절단에 위치하고 있습니다. 풀어DNA 수리의 수준에 비례이다 형광의 증가 끄는 (Dabcyl) 결과에서 차 초연. 복수를 수집하여 형광 값 읽기, BER 활동의 실시간 평가는 가능합니다. 표준 정량 실시간 PCR 악기의 사용은 많은 샘플의 동시 분석이 가능합니다. 이러한 BER 분자 비콘의 디자인은 하나의 기본 병변으로 운동 분석, BER의 부량 및 억제제 검증 의무가 있으며 조직과 종양 세포 lysates의 DNA를 복구 활동의 부량 또는 단백질 정제와 적응이다. 이러한 분자 비콘을 사용하여 종양 lysates이나 조직 aspirates의 BER 활동의 분석은 기능적인 biomarker 측정에 적용할 수 있습니다. 또한, 이러한 양적 분석을 사용하여 단백질을 정제와 BER 활동의 분석 BER 억제제의 발견 및 검증을위한 신속한 높은 처리량 방법을 제공합니다.

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Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

우리는 DNA glycosylase 및 세포 핵 lysates의 에이피 endonuclease 활동의 양적, 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 분석은 운동 분석 의무의 DNA 복구 활동의 속도를 얻을 조직과 종양의 lysates 또는 정화 단백질과 DNA를 복구 활동의 부량에 대한 적응이다.

병변 특정 분자 비콘을 활용 세포 Lysates의 기본 절단 복구 활동의 양적, 실시간 분석

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

써모 과학 솔라리스 qPCR 어세를 사용하여 정량 실시간 PCR

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연구

생물학

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

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에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

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정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

양적 휘트니스 분석 워크플로우

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

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형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

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대사 프로파일의 실시간 분석<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 마우스 장내 크립트 Organoid 문화

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

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프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

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qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...