Name: quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами от Питтсбурга и Фонда Национальных Институтов Здоровья (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] для RWS. Поддержка UPCI лентивирусов фонда была оказана RWS по поддержке онкологического центра грант от Национального института здоровья [P30 CA047904]. Была также оказана поддержка в Университете Питтсбурга кафедра фармакологии и химической биологии для DS. Была также оказана поддержка по ESTRO к резюме.

1. Молекулярный дизайн Beacon 1,1 Проектирование и заказ ваш молекулярной маяк Дизайн вашей молекулярной маяком должна учитывать следующее: <ol class="lalpha"><li> У нас есть хорошие результаты с 43-Мер олигонуклеотидов ДНК. Содержание ГК должна быть&gt; 32%. Исключить базе ...

<ol>
	<li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide.">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li><li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide.">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids.">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li><li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes.">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li><li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O(+6)-methylguanine+DNA+methyltransferase,+methylpurine+DNA+glycosylase,+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities:+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase.">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li><li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons.">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li><li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon.">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li><li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time.">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase.">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li><li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity.">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li><li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity.">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li><li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells.">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li><li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon.">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li><li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells.">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li><li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities.">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li></ol>

Есть более чем 600 цитат с помощью &quot;молекулярного маяк&quot; Срок для выявления и количественной оценки многочисленных молекул и ферментативную деятельность, включая деятельность геликазы 6, активность ДНК-полимеразы 7,8, ДНК-лигазы деятельности 9, активность теломераз?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Хлористый калий </td><td> Рыбак </td><td> P217-500 </td><td> Молекулярная класса </td></tr><tr><td> ЭДТА </td><td> Рыбак </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Глицерин </td><td> Рыбак </td><td> BP229-1 </td><td> Молекулярная класса </td></tr><tr><td> DVB-T </td><td> Рыбак </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-решения </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Соль </td><td> Сигма </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Гидроксид калия </td><td> Сигма </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μM фильтр </tг&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Слайд-A-анализатор, продукты диализа </td><td> Прокалывать </td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Шприц </td><td> Рыбак </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Игла </td><td> Рыбак </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Пробирки на 1,5 мл Микроцентрифуга </td><td> Рыбак </td><td> 05-408-129 </td><td> Черный </td></tr><tr><td> 15 мл Сокол трубы </td><td> Рыбак </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBuster белка Добыча Kit </td><td> Calbiochem </td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Молекулярные маяки </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRad белка анализ красителей повторноАгент концентрата </td><td> BioRad </td><td> Cat # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons

Мы опишем метод для количественного, в режиме реального времени измерения ДНК гликозилаза и AP эндонуклеазы деятельности в клетке ядерный лизатов с использованием базовых репарации (BER) молекулярные маяки. Подложки (маяк) состоит из deoxyoligonucleotide содержащие один поражение базы с 6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM) часть сопряженных с 5&#39;end и Dabcyl часть сопряженных с 3&#39;-конца олигонуклеотида. Маяк BER молекулярной 43 баз в длину и последовательность призвана содействовать формированию стволовых петля структуру с 13 нуклеотидов в петле и 15 пар оснований в стебле 1,2. В сложенном состоянии в этой конфигурации 6-FAM фрагмента гасится по Dabcyl в не-люминесцентные образом через Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) 3,4. Поражение расположена так, что после удаления поражение базы и нить разрыва оставшиеся 5 базой олигонуклеотида, содержащего 6-FAM часть освобождается от стебля. Отпуститей отряд из тушителя (Dabcyl) приводит к увеличению флуоресценции, которая пропорциональна уровню репарации ДНК. Собрав несколько операций чтения флуоресценции значений в реальном времени, оценка деятельности BER возможно. Использование стандартных количественный ПЦР в реальном времени инструментов позволяет одновременного анализа многочисленных образцов. Дизайн этих BER молекулярной маяки, с одним поражением базы, поддается анализу кинетических, BER количественного и ингибитор проверки и адаптируется для количественного определения ДНК ремонт деятельности в ткани опухоли и клеточные лизаты или очищенных белков. Анализ деятельности BER в опухолевых тканях лизатов или всасывает с помощью этих молекулярной маяки могут быть применимы к функциональным измерения биомаркеров. Кроме того, анализ деятельности с BER очищенных белков с помощью этого количественного анализа обеспечивает быструю, высокую пропускную способность метода для обнаружения и проверки BER ингибиторов.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons at JoVE.com

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Мы опишем метод для количественного, в режиме реального времени измерения ДНК гликозилаза и AP эндонуклеазы деятельности в клетке ядерный лизатов. Анализ дает темпы ремонта ДНК деятельности поддаются кинетического анализа и адаптации для количественного определения ДНК ремонт деятельности в ткани опухоли и лизатов или очищенных белков.

Количественные, в режиме реального времени анализ базы активность репарации в клеточных лизатов Использование Поражение конкретные молекулярные маяки

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Количественный ПЦР в реальном времени использованием Thermo Scientific Solaris КПЦР Пробирной

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Анализ экспрессии генов в Борер Изумрудный Эш ( Agrilus planipennis) С использованием количественных Real Time PCR-

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Профилирование Предварительно микро-РНК и микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени (КПЦР) Массивы

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Применение MassSQUIRM для количественного измерения Лизин активность деметилазы

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Количественный анализ рабочих процессов Фитнес

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

В режиме реального времени Анализ метаболического профиля в<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Мышь Кишечная Crypt Органоид Культуры

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Зонд на основе ПЦР в реальном времени подходов к количественному измерению микроРНК

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag анализ - Высокая пропускная способность, ПЦР в реальном времени Анализ на Sc2.0 Генотипирование

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...