Name: quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag från Pittsburgh Foundation och National Institutes of Health (NIH) [GM087798, CA148629, ES019498] för att RWS. Stöd för UPCl Lentiviral Facility lämnades till RWS genom Cancer Support Grant från National Institutes of Health [P30 CA047904]. Stöd gavs också av University of Pittsburgh Institutionen för farmakologi och kemisk biologi DS. Stöd gavs också av ESTRO till CV.

1. Molekylär design Beacon 1,1 Utforma och beställa din molekylära beacon Utformningen av din molekylär ledstjärna måste tänka på följande: <ol class="lalpha"><li> Vi har goda resultat med 43-mer-DNA oligonukleotider. GC-innehåll bör vara&gt; 32%. Utesluta en G bas vid 5&#39;-änden. </li><li> Begäran 6-FAM (6-karboxifluorescein) konjugering på 5&#39;-änden och Dabcyl som en 3 &#39;modifiering. </li><li> Positionen av lesionen bör ligga på basen # ...

<ol>
	<li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide.">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li><li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide.">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids.">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li><li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes.">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li><li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O(+6)-methylguanine+DNA+methyltransferase,+methylpurine+DNA+glycosylase,+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities:+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase.">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li><li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons.">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li><li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon.">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li><li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time.">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase.">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li><li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity.">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li><li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity.">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li><li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells.">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li><li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon.">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li><li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells.">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li><li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities.">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li></ol>

Det finns över 600 citat använder termen &quot;molekylära ledstjärna&quot; för att upptäcka och kvantifiera många molekyler och enzymatiska aktiviteter, inklusive helikasaktivitet 6, DNA-polymeras aktivitet 7,8, DNA-ligas aktivitet 9, telomerasaktivitet 10, DNA photolyase aktivitet 11 och DNA / RNA-hybrider 12, bland många andra. Förutom användningen av molekylära fyrar för mätning av de aktiviteter DNA-reparation som anges ovan, har vi och a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Kaliumklorid </td><td> Fisher </td><td> P217-500 </td><td> Molekylärbiologisk kvalitet </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fisher </td><td> BP229-1 </td><td> Molekylärbiologisk kvalitet </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Fisher </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-lösning </td><td> Invitrogen </td><td> 15.630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-salt </td><td> Sigma </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumhydroxid </td><td> Sigma </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 filtret </td&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-analysatorn dialysprodukter </td><td> Pierce </td><td> 66.373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Spruta </td><td> Fisher </td><td> 309.659 </td><td></td></tr><tr><td> Nål </td><td> Fisher </td><td> 305.196 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml mikrocentrifugrör </td><td> Fisher </td><td> 05-408-129 </td><td> Svart </td></tr><tr><td> 15 ml Falcon-rör </td><td> Fisher </td><td> 352.097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBuster Protein Extraction Kit </td><td> Calbiochem </td><td> 71.183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14.190 </td><td></td></tr><tr><td> Molecular Beacons </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biorad proteinanalys färgämne remedlet koncentrat </td><td> BioRad </td><td> Cat # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons

Vi beskriver en metod för kvantitativ realtids-mätning av DNA glykosylas och AP verksamheten endonukleas i cellnukleära lysaten med bas excision reparation (BER) molekylära fyrar. Substratet (signal) består av en deoxioligonukleotid med en enda bas lesion med en 6-karboxifluorescein (6-FAM) grupp konjugerad till 5&#39;-änden och en Dabcyl grupp konjugerad till 3&#39;-änden av oligonukleotiden. BER molekylära fyren är 43 baser i längd och sekvensen är utformad för att gynna bildandet av en stam-loop struktur med 13 nukleotider i slingan och 15 baspar i stammen 1,2. När den är hopfälld i denna konfiguration 6-FAM-delen avbryts genom Dabcyl i en icke-fluorescerande sätt via Förster-energiöverföring (FRET) 3,4. Lesionen är placerad så att efter avlägsnande bas lesion och strängen klyvning återstående 5 bas oligonukleotid innehållande 6-FAM-delen frigörs från skaftet. Släpp ennd avskildhet från släckningsenheten (Dabcyl) resulterar i en ökning av fluorescens som står i proportion till nivån på DNA-reparation. Genom att samla flera läser av fluorescens värden är i realtid bedömning av BER verksamheten möjlig. Användningen av standard kvantitativ realtids-PCR-instrument medger samtidig analys av flera prov. Utformningen av dessa BER molekylära fyrar, med en enda bas lesion, är mottaglig för kinetiska analyser, BER kvantifiering och hämmare validering och är anpassningsbar för kvantifiering av DNA-reparation aktivitet i vävnader och tumör cellysater eller med renad proteiner. Analysen av gruppundantagsförordningen aktivitet i tumör lysat eller vävnad aspirerar som använder dessa molekylära fyrar kan vara tillämpliga på funktionella biomarkör mätningar. Vidare tillhandahåller analys av BER aktivitet med renade proteiner med användning av denna kvantitativ analys en snabb, högeffektiv metod för upptäckt och validering av BER-inhibitorer.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons at JoVE.com

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Vi beskriver en metod för kvantitativ realtids-mätning av DNA glykosylas och AP verksamheten endonukleas i cellnukleära lysat. Analysen ger hastigheter av DNA-reparation aktivitet som lämpar sig för kinetisk analys och är anpassningsbar för kvantifiering av DNA-reparation aktivitet i vävnad och lysat tumör eller med renade proteiner.

Kvantitativ Real-time Analysis of Base excision reparation aktivitet i cellysat Produkten bygger på sårspecifik Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Kvantitativa realtids-PCR med Thermo Scientific Solaris qPCR analys

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Analys av genuttryck i Emerald Ash tillväxtborr ( Agrilus planipennis) Med kvantitativa realtid-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Profilering av Pre-mikro-RNA och mikroRNA hjälp av kvantitativ realtids-PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Tillämpning av MassSQUIRM om kvantitativa mätningar av Lysin demetylas aktivitet

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

En kvantitativ Fitness analys Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analys av Metabolic profil i<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mouse Intestinal Crypt organoid kulturer

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-baserade Real-time PCR Approaches för kvantitativ mätning av mikroRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analys - En hög genomströmning, Realtid PCR-analys för Sc2.0 Genotypning

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...