Name: a simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars
Uploaded: 2012-11-15T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars at JoVE.com

TMS werd gesteund door de Harlan Trust Fellowship (GWU) tijdens deze studie. Financiering voor veld verzamelen en kweken van L. Fasciola en E. delphinii werd verstrekt door NSF subsidie ​​DEB 0642438 naar JTL.

1. Materiaal Voorbereiding <ol><li> Bereid naalden (1-2 micrometer tip en 3-4 mm conus) van borosilicaatglas capillaire buizen en een micropipet trekker. Instrument instellingen: helling: 561; snelheid: 20; warmte: 560; vertraging: 1; pull: 100; druk: 500. </li><li> Bereid de verzameling oplossing: 60% Medium Grace&#39;s (GM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 20% antistollingsmiddel buffer (98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA en 41 mM citroenzuur, pH 4,5 ). De bovenstaande oplossing wordt vers bereid ond...

<ol>
	<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom.">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes:+masters+of+multitasking.">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).</li><li>Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+cellular+immune+response.">The insect cellular immune response.</a> Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).</li><li>Fauvarque, M. O., Williams, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+cellular+immunity:+a+story+of+migration+and+adhesion.">Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion.</a> J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).</li><li>Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+the+cellular+and+humoral+responses+in+the+Drosophila+host+defense+against+three+gram-positive+bacterial+infections.">Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections.</a> PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).</li><li>Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., R&#228;met, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+phagocytosis+-+still+many+unknowns+under+the+surface.">Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface.</a> APMIS. 119 (10), 651 (2011).</li><li>Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+hemocyte+migration:+an+in+vivo+assay+for+directional+cell+migration.">Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).</li><li>Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+immunity.">Mosquito immunity.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218 (2010).</li><li>Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hemocytes+from+the+mosquitoes+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti.">Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).</li><li>Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+in+lepidopteran+insects.">Immunity in lepidopteran insects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181 (2010).</li><li>Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmatocyte-spreading+peptide+(PSP)+plays+a+central+role+in+insect+cellular+immune+defenses+against+bacterial+infection.">Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection.</a> J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).</li><li>Ribeiro, C., Breh&#233;lin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+haemocytes:+what+type+of+cell+is+that.">Insect haemocytes: what type of cell is that.</a> J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).</li><li>Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+between+larval+and+pupal+hemocytes+of+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta,+determined+by+monoclonal+antibodies+and+density+centrifugation.">Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation.</a> J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).</li><li>Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+hemocyte+counts+with+different+developmental+parameters+during+the+last+larval+instar+of+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta.">Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).</li><li>Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+tri-trophic+interaction+between+insects,+nematodes+and+Photorhabdus.">Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus.</a> Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).</li><li>Qayum, A. A., Telang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+Collecting+and+Staining+Hemocytes+from+the+Yellow+Fever+Mosquito+Aedes+aegypti.">A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti.</a> J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).</li></ol>

Werkwijzen voor het extraheren van hemocyten medisch belangrijke lepidoptera insecten en insecten model eerder gemeld 9, 14. Hemocyte extractie zijn aangepast op basis van de insectensoorten, de ontwikkelingsfase van het insect en de morfologische kenmerken. Zo kan hemolymfe isolatie van Manduca larven gemakkelijk worden uitgevoerd door knippen de gebogen hoorn het einde van de buik 15. Omdat slug rupsen (Limacodidae) missen deze buik structuur, hebben we een aparte protocol voor hemolymfe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Micropipet trekker </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> P-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicaatglas buizen </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> B100-50-10 </td><td> OD: 1,0, ID: 0,50 mm </td></tr><tr><td> Grace&#39;s Medium </td><td> Sigma </td><td> G8142 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SH3007102 </td><td> Hitte geïnactiveerd </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Forceps </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.252-40 </td><td></td></tr><tr><td> Neubauer hemocytometer </td><td> Hausser Wetenschappelijke </td><td> 3200 </td><td></td></tr><tr><td> Plastic Tubing </td><td> Tri-Tech </td><td> TT-3-32OD </td><td> OD: 3/32&#39;&#39;, ID: 1/32 &#39; </td></tr><tr><td> Glas medische spuit </td><td> Fortuna Optima </td><td> D-97877 </td><td> 50 ml volume </td></tr><tr><td> Stomp uiteinde naald </td><td> Kleine onderdelen </td><td> NE-162PL-25 </td><td> 16 Gauge x 1 &quot;lengte </td></tr></tbody></table>

a simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars

Insect hemocyten (gelijk aan zoogdieren witte bloedcellen) spelen een belangrijke rol in diverse fysiologische processen in het leven van een insect cyclus 1. In larvale stadia van insecten behorend tot de orde van de Lepidoptera (motten en vlinders) en Diptera (ware vliegen), worden hemocyten gevormd uit de lymfeklier (een gespecialiseerde hematopoietische orgel) of embryonale cellen en kan worden uitgevoerd door middel van het volwassen stadium. Embryonale hemocyten zijn betrokken bij celmigratie gedurende de ontwikkeling en chemotaxis regelgeving tijdens de ontsteking. Zij nemen ook deel in cel apoptose en zijn essentieel voor embryogenese 2. Hemocyten bemiddelen de cellulaire arm van het insect aangeboren immuunrespons die verschillende functies, zoals celspreiding, cel aggregatie, vorming van nodules, fagocytose en inkapseling van indringers 3 omvat. Zij zijn ook verantwoordelijk voor het orkestreren specifieke humorale afweer insect tijdens infectie, zoals de productie van antimicrobiële peptiden en andere effectormoleculen 4, 5. Hemocyte morfologie en functie zijn voornamelijk bestudeerd in genetische of fysiologische insect modellen, zoals de fruitvlieg Drosophila melanogaster 6, 7, de muggen Aedes aegypti en Anopheles gambiae 8, 9 en de tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. Er is echter weinig informatie bestaat momenteel over de diversiteit, classificatie, morfologie en functie van hemocyten in niet-model insectensoorten, met name die uit het wild gehaald 12. Hier beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor de extractie van hemocyten van wilde rupsen. We gebruiken voorlaatste instar Lithacodes Fasciola (geel-schouders slug mot) (figuur 1) en Euclea delphinii (spiny eiken slug) rupsen (Lepidoptera: Limacodidae) en laten zien dat er voldoende hoeveelheden hemolymfe (insect bloed)kan worden geïsoleerd en hemocyte aantal getelde van individuele larven. Deze methode kan worden gebruikt om efficiënt onderzoeken hemocyte types in deze soorten en in andere lepidoptera rupsen geoogst van het veld, of het kan eenvoudig worden gecombineerd met immunologische assays ontworpen hemocyte functie onderzoeken na infectie met bacteriën of parasitaire organismen 13.

Het protocol hier beschreven staat de inzameling toe van een minimaal volume van 10-20 ul van insecten hemolymfe van individuele rupsen. Hemocyten verzameld via deze werkwijze zijn vrij van cellen klonteren, melanisatie gebreken weefsel vuil of andere verontreinigingen. Daarom hemocyten gemakkelijk kunnen worden waargenomen en geteld onder de microscoop en diverse insecten kunnen worden waargenomen binnen een paar Hosur. We hebben waargenomen dat de meeste hemocyten in onze monsters bestonden uit plasmatocytes 3</s...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars at JoVE.com

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocyten voeren tal van belangrijke functies, zowel immune als niet-immune, in alle stadia van insecten ontwikkeling. Onze huidige kennis van hemocyte soorten en functie komt van studies over insecten genetische modellen. Hier presenteren we een methode voor het extraheren, het kwantificeren en visualiseren hemocyten van wilde rupsen.

Een eenvoudig protocol voor het extraheren van hemocyten van Wild Rupsen

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Research

JoVE Journal

Biology

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

Extraheren van DNA uit de Gut Microben van de Termite (Zootermopsis Angusticollis) en visualiseren Gut microben

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

Protocol voor Mosquito Opfok (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: een eenvoudige methode voor Nauwkeurige Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

Protocol voor het kweken van sympathische neuronen van Rat Superior Baarmoederhalskanker ganglia (SCG)

The superior cervical ganglia (SCG) in rats are small, glossy, almond-shaped structures that contain sympathetic neurons.  These neurons provide ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Een protocol voor de productie van KLRG1 tetrameer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Een PCR-gebaseerde genotyperingsmethode onderscheid te maken tussen wild-type en Sier Rassen van Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM protocol voor de ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

Een eenvoudige bioassays voor de beoordeling van de vasculaire endotheliale groeifactoren

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

Een methode voor het extraheren Pigmenten van Squid<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...