Name: a modified epa method 1623 that uses tangential flow hollow-fiber ultrafiltration and heat dissociation steps to detect waterborne cryptosporidium and giardia spp.
Uploaded: 2012-07-09T13:00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia

Vi vil gerne takke Ann Grimm og Michael Zimmerman for kritisk gennemgang af dette manuskript og Doug Hamilton for hans teknisk support.

1. Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltrering Fremgangsmåde <ol><li> Fremstilling af buffere og opløsninger: Elueringsopløsning (1 L): Til 1 liter reagenskvalitet vand tilsættes 0,1 g natriumpolyphosphat, 0,1 ml Tween-80 og 0,01 ml Y-30 antiskummiddel. </li><li> Forberede filterkonstruktion (figur 1) i en biologisk sikkerhedsskab: <ol><li> Indsæt Masterflex I / P 73 Lab slange gennem en Masterflex I / P Easy-Load pumpehovedet forbundet til en Masterflex I / P præcision børsteløs drev. </li><li> Fastgøre slangen til en 0-60 psi, glycerin fyldt trykmåler forsynet med et NPT gren T-konnektor opstrøms pumpehovedet med en skrueklemme, og en HDPE T-konnektor nedstrøms pumpehovedet. </li><li> Samle retentatet flasken ved at anbringe en Nalgene 53-B fyldning / udluftningshætte med Masterflex L / S 15 lab slange og en T-konnektor og fæstnes til en 1 L Nalgene tunge polypropylenflaske. </li><li> Fit Masterflex L / S 24 slanger wed en knivspids klemme (klemme klemme 2) og tilslut det fra retentat flasken til HDPE T-stik. </li><li> Forbinde Masterflex L / S 24 lab rør fra trykmåleren til Asahi Kasei Rexeed 25S høj flux dialysator med en skrueklemme, og fra dialysatoren til retentatet flasken. Anvende skræddersyede DIN adaptere konstrueret til ¼ &quot;ID rør til at forbinde slangen med hulfiber-ultrafilter. </li><li> Fit Masterflex L / S 24 lab rør, med en knivspids klemme (knivspids klemme 1) og tilslut den til en 10 ml plastik pipette med spidsen og bomuld stikket fjernes for at fungere som prøven optagelse linje og derefter fastgør slangen til HDPE T- stik. </li><li> Passer den ene ende af Masterflex L/S-36 lab rør med en rampe klemme og forbinder slangen med effluenten port placeret nær udløbsenden af ​​filteret. Anbring den anden ende i affaldscontaineren. </li></ol></li><li> Tilsættes 0,01% (w / v) natriumpolyphosphat med 10 L vand prøve og blandes i 3 minutter. </li><li> Lukke knivspids klemme 2og fjerne udluftningsåbningen hætten fra retentatet flasken. Alle andre klemmer skal være åben. </li><li> Indstille pumpens retning for at flytte væske fra T-konnektor til trykmåleren (højre til venstre følgende figur 1). Justere pumpehastigheden til 25% af den maksimale hastighed og tænde pumpen. </li><li> Når retentatet flasken er 2/3 fuld, åben knivspids klemme 2 og hurtigt erstatte udluftning hætten til retentatet flasken. Tjek alle de linjer og fittings til at sikre, at der ikke er utætheder. </li><li> Langsomt øger pumpens hastighed til det ønskede filtrationshastighed (ca. 1,5 L / min), kontrol for utætheder. Ved anvendelse af en gradueret cylinder og en timer eller en strømningsmåler, se filtratet hastigheden af vandet kommer ud fra afgangsledningen (blå L / S 36 rør i figur 1). Luftbobler kan typisk dannes ved udgangsenden af ​​filteret gør det vanskeligt at opnå et stabilt tryk og filtreringshastighed. Dette korrigeres ved at knibe spildevand linje med hånden et øjeblik. Denne handlingvil generelt coax luftboblen til filtratet port og afslutte via afgangsledningen. Gentag efter behov, holde sig for øje, at ært størrelse luftbobler er ofte uundgåelige. </li><li> Overvåge filtreringsprocessen. Måle og registrere tryk og filtreringshastigheden efter behov. Trykket bør aldrig overstige 20 psi. Det anbefales, at filtreringshastigheden ikke bør overstige 2,0 L / min. Det er vigtigt, at mængden af ​​vand i retentatet flasken overvåges for at sikre, at det aldrig tømmes. Det er normalt for volumen for at øge eller falde en smule. Hvis vandmængden i retentatet flasken falder til under 1/3 fuld, og fjern derefter udluftning hætte og tæt knivspids klemme 2 på retentatet flasken linje. Bring lydstyrken tilbage til omkring 2/3 fuld, skal du åbne klemmen og hurtigt udskifte ventilen hætten, hvilket sikrer en tæt forsegling. Hvis volumen i retentatet flasken falder hurtigt og kontinuerligt, så sikrer den retentatet flasken låget er tæt og udluftning hætten er sikkert på plads, og at Tubing stadig er i kontakt med vandet prøven. Hvis disse spørgsmål ikke forekommer, så er det sandsynligt, at forseglingen i retentatet flasken låget er dårlig og skal udskiftes. </li><li> Når prøven beholderen er tom, umiddelbart tæt knivspids klemme 1 reducere pumpehastigheden til 20% af sin maksimale, fjernes udluftningsåbningen hætten fra retentatet flasken og lukke rampen klemmen. </li><li> Juster lydstyrken på prøven i retentatet flasken til ca 200 ml ved at stramme eller løsne rampen klemme. Når volumen er ca 200 ml, spænd rampen klemme for elueringstrin (1,11-1,12). </li><li> Tilsættes 500 ml af elueringsopløsningen til prøvebeholderen og skyl indersiden af ​​beholderen. Anbring 10 ml pipette forbundet med prøven optagelse linie i beholderen, der indeholder elueringsopløsning. Sørg for, at rampen klemmen er lukket. Open knivspids klemme 1 og tæt knivspids klemme 2 et øjeblik for at udarbejde elueringsopløsningen. </li><li> Efter at 500 ml af elueringsopløsningen er opstilletTæt klemme klemme 1 og åben pinch klemme 2. Tillade elueringsopløsning at cirkulere i 5 minutter med en pumpehastighed på 20% af dens maksimum. </li><li> Justere volumenet af prøven i retentatet flasken til omkring 100 ml ved at stramme eller løsne rampen klemmen på afgangsledningen. Stramme rampen klemmen og tillade prøven til at cirkulere i 1 minut. Undgå at trække luft ind i røret ved at sikre volumenet af prøven i retentatet flasken er høj nok til at dække L / S 15 slangen ind i retentatet flasken. </li><li> Vende retningen af ​​pumpen, der tvinger prøven i retentatet flasken. Tillade pumpen at køre baglæns i 20 sekunder resulterede i en total på ~ 225 ml i retentatet flasken. Sluk for pumpen. </li><li> Fjern Masterflex I / P 73 slangen fra pumpehovedet og fjern trykmåleren. Tag Masterflex L / S 24 slanger forlader hule-fiber ultrafilter. Hold røret over retentatet flasken for at tvinge eventuelle resterende prøve iretentat flaske. </li><li> Afbryde alle rør fra flasken og erstatte udluftningshætte med en ikke-udluftningshætte. </li><li> Fortsæt til IMS / IFA procedure med ~ 225 ml retentat. </li></ol> 2. Immunomagnetisk separation Fremgangsmåde <ol><li> Fremstilling af buffere og opløsninger: <ol><li> Lad buffere, der indgår i de Dynabeadsene: Cryptosporidium / Giardia kombosæt at nå stuetemperatur. </li><li> 1X SL-buffer A: Tilsæt 1 ml af 10X SL-puffer A til 9 ml af reagenskvalitet vand. </li></ol></li><li> Overføre ~ 225 ml af væske fra retentatet flasken til en mærket 250 ml konisk centrifugerør. Skyl retentatet flasken to gange med 10 ml af reagens vand og tilsæt skylninger med konisk centrifugerør. Centrifugeres suspensionen ved 1500 x g i 15 minutter ved 4 ° C uden bremse. </li><li> Omhyggeligt aspirere supernatanten fra luft-vand grænsefladen til 5 ml over det pakkede pelleten for hver 0,5 ml pellet volumen (dvs. aspirat til en5 ml over en pellet volumen på 1,3 ml og aspirat til 5 ml af en pellet af 0,5 ml eller mindre). </li><li> Grundigt pellet resuspenderes i supernatanten ved hvirvelblanding og / eller pipette blanding. Overfør hver 5 ml volumen af ​​væsken til fladsidet Dynal L10 rør indeholdende 1 ml hver af 10X SL-puffer A og 10X SL-puffer B. skylles konisk centrifugerør to gange med 2,5 ml af reagens vand og tilsæt skylning med Den L10 røret, hvorved det samlede volumen i L10 røret til 12 ml, herunder buffere. </li><li> Tilsæt 100 pi hver af velblandet resuspenderede anti-Cryptosporidium og anti-Giardia Dynabeads til L10 røret. Rotere L10 røret ved 18 rpm i 1 time ved stuetemperatur på en rotator blander. </li><li> Anbring den flade side af L10 røret mod MPC-6 magnet og forsigtigt hånd klippe røret ende-til-ende 180 ° C i 2 minutter. </li><li> Holde L10 røret i MPC-6 magnet med magneten opad, dekanteres fra vulsten / (oo) cyste komplekser Bound til magneten. Fjerne L10 røret fra magneten, og der tilsættes 0,5 ml 1X SL-puffer A til røret. Overføre suspensionen ved hjælp af to yderligere skylninger med 0,5 ml 1X SL-puffer A til et 1,5 ml mikrocentrifugerør holdes i MPC-S med magnet i den lodrette stilling. </li><li> Ryst forsigtigt røret i MPC-S magnet 180 ° C i 1 minut. Med magneten på plads, aspireres supernatanten under anvendelse af en Pasteur-pipette rettet mod bunden af ​​mikrocentrifugerør. </li><li> Tilsæt 1 ml 1X PBS til forsiden af ​​mikrocentrifugerør, fjerne magneten og vippe røret forsigtigt lige indtil perlerne resuspenderes. Erstatte magnet i den lodrette stilling og forsigtigt rokke røret 180 ° C i 1 minut. Aspirer PBS skylning, uden at forstyrre kuglepelleten under anvendelse af en Pasteur-pipette for at fjerne så meget affald som muligt. </li><li> Fjerne magneten og der tilsættes 50 ul reagens vand til bagsiden af ​​mikrocentrifugerør. Vortex røret ved fuld hastighed i 50 sekunder,Derefter inkuberes røret ved 80 ° C i 10 minutter efterfulgt af en 30 sekunders vortex. Erstatte magnet MPC-S i den skrå stilling, binding til perler til magneten og forlader (oo) cyster i væsken. Påfør (oo) cyster suspension til en SingleSpot godt slide. </li><li> Gentage trin 2.10, anvender væsken til det samme brønd indeholdende det første dissociation. Sted glider på en 37 ° C objektglasvarmeanordning i 1 time for at tørre suspensionen til objektglasset brønd. </li></ol> 3. Farvning og Undersøgelse <ol><li> Fremstilling af buffere og opløsninger: Arbejder DAPI opløsning: Tilsæt 25 gl DAPI stamopløsning (2 mg / ml i methanol) til 25 ml 1X PBS. Store lager-og arbejdsvilkår løsninger mellem 1 ° C og 10 ° C i mørke. </li><li> Anvendes 50 pi methanol til objektglasset godt og lad det tørre ved stuetemperatur. </li><li> Tilsættes 50 ul af den arbejdende DAPI løsning på objektglasset brønd og inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Brug en Kimwipe til vægen af ​​DAPI fra brønden. Anvend 50 pi EasyStain. Inkuber ved 35 ° C i 30 minutter. </li><li> Væge pletten fra brønden med en Kimwipe, og tilsæt derefter langsomt 300 gl koldt EasyStain fastsættelse buffer, som gør det muligt at strømme over brønden kanten. Inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Anvender en Kimwipe at opsuge bufferen fra brønden og anvende 10 ul EasyStain Mounting Medium. </li><li> Påfør forsigtigt et dækglas, fjerne eventuelle bobler, der opstår. Forsegl dækglasset med klar neglelak. </li><li> Scan hele diaset ved hjælp af FITC-filter, ved 200X samlet forstørrelse, for ægformede eller sfærisk æble-grønne fluorescerende objekter, der ligner en Oocysten eller cyste. Undersøg alle sådanne objekter med DAPI-filter ved 1000 total forstørrelse og derefter med DIC, også på 1000X total forstørrelse. Optage størrelse ved hjælp af et kalibreret okular mikrometer og morfologiske karakteristika. </li><li> Document resultater. </li></ol> Bemærk: Yderligere oplysningeroplysninger om den oprindelige procedure kan findes i december 2005 versionen af EPA metode 1623 12. Den tangentielle strømning hulfiber-ultrafiltrering beskrevne fremgangsmåde anvendes i stedet for afsnit 12,0 EPA metode 1623. Varmen dissociation ændrer § 13.3.3 af EPA metode 1623. Fremgangsmåden beskriver også en yderligere PBS skylning under IMS proces, som kan indsættes i december 2005-udgaven af ​​Metode 1623 efter afsnit 13.3.2.16. Den komplette liste over forbrugsvarer, reagenser og udstyr, der anvendes til EPA metode 1623, herunder disse ændringer er opført på liste over udstyr. 4. Repræsentative resultater Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster genvindes gennem processer filtrering og immunomagnetisk separation detekteres ved mikroskopisk analyse. Ved 200X total forstørrelse, udviser hver organisme en typisk farvningsmønster, størrelse og form som vist i fig 2 </strong&gt; bemaerkes endvidere med immersionsolie ved 1000X total forstørrelse. Dette vil give mulighed for måling og identifikation af enten typiske afgørende træk eller atypiske funktioner, der ville udelukke positiv identifikation. Cryptosporidium er en ægformet til sfærisk objekt 4 til 6 um i diameter, der udviser fremragende æble-grønne FITC fluorescens med stærkt fremhævet kanter (fig. 3A ). Med DAPI UV, vil en oocyst udviser en af ​​de følgende typiske træk kategorier: lyseblå indre farvning med en grøn rand og ingen tydelig kerner (DAPI negativ), intens blå indre farvning, eller op til fire forskellige, himmelblå kerner (DAPI positiv - figur 3B). Atypiske funktioner omfatter afvigelser i farve, struktur eller DAPI fluorescens (f.eks, for mange farvede kerner, rød fluorescerende interne strukturer). Hvis fluorescerende objekt har opfyldt kriterierne for typiske FITC og DAPI farvning, er det undersøgt ved hjælp af forskellen interferens conman derimod (DIC). Objektet er undersøgt for atypiske ydre eller indre morfologiske karakteristika såsom cellevæg ornamentering, eller en eller to store kerner fyldning af cellen. Hvis atypiske strukturer ikke overholdes, er genstanden registreres i alt IFA tæller og kategoriseres som en tom amorf struktur eller med en til fire sporozoiter foreliggende (fig. 3C). Tilsvarende er Giardia-lignende genstande undersøgt med hensyn til FITC og DAPI farvning samt DIC egenskaber, som axonemes, median organer, og kerner Giardia cyster er runde til ægformede strålende æble-grønne genstande, 8 -. 18 um lange med 5 - 15 um bred med stærkt fremhævede kanter (figur 3D). Med DAPI UV vil Giardia cyste udviser DAPI-negativ farvning eller DAPI-positive egenskaber (fig. 3E). Den fluorescerende objekt undersøges ved DIC for typiske og atypiske træk på samme måde som beskrevet for Cryptosporidium.Hvis atypiske funktioner ikke overholdes, bliver objektet registreret i det samlede IFA tæller og kategoriseret som tomme indeholder amorf struktur, eller med en eller flere typer af interne strukturer til stede (figur 3F). Enhver organisme, der er observeret at have atypiske funktioner, bør ikke medregnes som en (oo) cyste. Mikroskopisk analyse af miljøprøver kan være en udfordring, som der er organismer, som kan automatisk fluorescerer eller krydsreagere med det FITC-konjugeret anti-Cryptosporidium og / eller anti-Giardia-antistoffer 1. Det anbefales, at en analytiker være fortrolig med akvatiske mikrober og gennemgå et stort antal dias at få erfaring identificere Cryptosporidium og Giardia. Mindst tre (oo) cyster på den positive farvning styreglideren skal karakteriseres forud for hver session ved mikroskopet. Kvalitetskontrol prøver kan spiket med (oo) cyster til at bestemme procent recOvery for hver protozo ved hjælp af beregning: (Oo) cyster Procent Recovery = ((QC Sample Count - Tæl fra Unspiked Sample) / Spike) x 100. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" /> Figur 1. Grafisk repræsentation af den tangentielle strømning hulfiber-ultrafiltreringssystemet. Slangen er farvekodet for at støtte samling af systemet. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" /> Figur 2. Repræsentativt fluorescens billede af Cryptosporidium og Giardia (oo) cyster. Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster blev farvet med FITC-mærket anti-Cryptosporidium / Giardia antistoffer. Arrows, Giardia cyster, pilespidser, Cryptosporidium oocyster. I alt fire Cryptosporidium-oocyster og seks Giardia cyster blev fundet i fokusplanet. Prøver obsered under 200X forstørrelse. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" /> Figur 3 Repræsentative mikroskopiske billeder af Cryptosporidium-oocyster og Giaridia cyster, der anvendes til karakterisering Cryptosporidium-oocyster (A - C).. Brilliant æble-grønne FITC fluorescens af sfæriske objekter 4 til 6 um i diameter med klart markerede kanter (A), som indeholder op til fire særskilte, himmelblå DAPI kerner (B) og en til fire sporozoitter (S) pr Oocysten (C). Giardia cyster (D - F). Brilliant æble-grøn FITC fluorescens af runde til ægformede objekter 8 - 18 um lang og 5 - 15 um bred med stærkt fremhævede kanter (D) indeholdende op til fire himmelblå DAPI kerner (E) og med en eller flere skelnelig indre struktur, såsom som kerner (N), median organ (M) og eller axonemes (A) (F). Hvide pile, strålende æblegrøn fluorescensfarvning Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster wVægge; hvide pilespidser, DAPI positive kerner. Prøverne observeret under 1000X forstørrelse.

<ol>
	<li>DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptosporidium+and+Giardia+recoveries+in+natural+waters+by+using+Environmental+Protection+Agency+Method+1623.">Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952 (2002).</li><li>Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistate+evaluation+of+an+ultrafiltration-based+procedure+for+simultaneous+recovery+of+enteric+microbes+in+100-liter+tap+water+samples.">Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).</li><li>Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+method+for+simultaneous+recovery+of+diverse+microbes+in+drinking+water+by+ultrafiltration+with+sodium+polyphosphate+and+surfactants.">Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).</li><li>Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+hollow-fiber+ultrafiltration+to+the+USEPA+VIRADEL+technique+and+USEPA+method+1623.">Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623.</a> J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).</li><li>Holowecky, P. M., James, R. R., Lorch, D. P., Straka, S. E., Lindquist, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+ultrafiltration+cartridges+for+a+water+sampling+apparatus.">Evaluation of ultrafiltration cartridges for a water sampling apparatus.</a> J. Appl. Microbiol. 106, 738-7347 (2009).</li><li>Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+ultrafiltration+to+concentrate+and+detect+Bacillus+anthracis,+Bacillus+atrophaeus+subspecies+globigii,+and+Cryptosporidium+parvum+in+100-liter+water+samples.">Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples.</a> J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).</li><li>Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+1MDS+electropositive+microfilters+for+simultaneous+recovery+of+multiple+microbe+classes+from+tap+water.">Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 260-266 (2007).</li><li>Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+hollow-fiber+ultrafiltration+primary+concentration+of+pathogens+and+secondary+concentration+of+viruses+from.">Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from.</a> 176, 38-45 (2011).</li><li>Shaw, N. J., Villegas, L. F., Eldred, B. J., Gaynor, D. H., Warden, P. S., Pepich, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+to+EPA+Method+1623+to+address+a+unique+seasonal+matrix+effect+encountered+in+some+U.S.+source+waters.">Modification to EPA Method 1623 to address a unique seasonal matrix effect encountered in some U.S. source waters.</a> J. Microbiol. Methods. 75, 445-448 (2008).</li><li>Simmons, O. D., Sobsey, M. D., Heaney, C. D., Schaefer, F. W., Francy, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+detection+of+Cryptosporidium+oocysts+in+surface+water+samples+by+method+1622+using+ultrafiltration+and+capsule+filtration.">Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1123-1127 (2001).</li><li>Sobsey, M. D., Glass, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+water+quality+on+enteric+virus+concentration+by+microporous+filter+methods.">Influence of water quality on enteric virus concentration by microporous filter methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47, 956-9560 (1984).</li><li>USEPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+1623:+Cryptosporidium+and+Giardia+in+Water+by+Filtration/IMS/FA.">Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA.</a> Office of Water. 815-R-05-002, (2005).</li><li>Ware, M. W., Wymer, L., Lindquist, H. D., Schaefer, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+alternative+IMS+dissociation+procedure+for+use+with+Method+1622:+detection+of+Cryptosporidium+in+water.">Evaluation of an alternative IMS dissociation procedure for use with Method 1622: detection of Cryptosporidium in water.</a> J. Microbiol. Methods. 55, 575-583 (2003).</li><li>Zuckerman, U., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portable+continuous+flow+centrifugation+and+method+1623+for+monitoring+of+waterborne+protozoa+from+large+volumes+of+various+water+matrices.">Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices.</a> J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).</li></ol>

United States Environmental Protection Agency via kontoret for Forskning og Udvikling i samarbejde med Office af grundvand og drikkevand Tekniske Support Center finansieret forskning beskrevet her. Alt arbejde blev støttet on-site på US EPA, Cincinnati, Ohio. Selv om oplysningerne beskrevet i denne artikel er blevet finansieret helt eller delvist af United States Environmental Protection Agency under kontrakt (kontrakt EP-C-06-031) til Shaw Miljø og Infrastruktur, Inc, betyder det ikke nødvendigvis afspejler de synspunkter, agenturet, og ingen officiel godkendelse skal udledes. Det er blevet udsat for agenturets og godkendt til offentliggørelse.

Tangential flow hulfiber-ultrafiltrering er en alternativ og effektiv teknik til den oprindelige koncentration af Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster fra vand. Hulfiber-ultrafiltrering er billigere end traditionelle filtre. Idet det har evnen til at koncentrere Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster fra en række forskellige vand matricer er et nyttigt alternativ til de nuværende filtreringsteknikker, der anvendes til EPA metode 1623. Som med de fleste andre filtreringsmetoder er hule fiber ultrafiltrering tilbøjelige til tilstopning med ekstremt uklare prøver. Højt vandtryk ville resultere fra filteret begroning, og derfor anbefales det at overvåge trykket under filtrerings-kørsel. Ud over Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster er hule fiber ultrafiltrering blevet vist at være i stand til at koncentrere bakterier og vira 1-3,5,8. Hulfiber-ultrafiltrering outlined ved denne fremgangsmåde kan anvendes til at koncentrere flere organismer i en enkelt prøve. Det er bemærkelsesværdigt, at opnå et endeligt volumen mellem 200 og 250 ml er den kritiske sidste trin i koncentrationen proceduren, således at ekstra centrifugeringstrin, der kan resultere i (oo) cyste tab undgås (trin 2.2). Men kan så lydstyrken i flasken til at falde for lavt have negative konsekvenser for de inddrevne beløb, da der ikke vil være nok væske volumen til at tvinge alle oocysterne eller cyster i retentatet flasken. Derfor anbefales det at opretholde et slutvolumen mellem 200 og 250 ml. Varme dissociation er et alternativ til syredissociations trin i fremgangsmåde 1623. Denne alternative trin har vist sig at forbedre Cryptosporidium oocyst genvinding og reducerer fremgangsmåden variation, når isoleret fra enten flod-eller reagens vand 9. En side-ved-side sammenligning af syre og varme dissociations fremgangsmåder vist, at ved anvendelse af varme til dissociate organismer fra de immunomagnetiske perler fremstillet højere gennemsnitlig inddrivelser for både Cryptosporidium og Giardia. Desuden var præcisionen af Cryptosporidium og Giardia genfindelse bedre i prøver der er behandlet med varme dissociation sammenlignet med syredissociations 9. Inkorporeringen af ​​HFUF som koncentrationen trin tillader større fleksibilitet ved at tilvejebringe evnen til at koncentrere flere organismer. Desuden er det et billigere alternativ til nuværende metode 1623 filtrering muligheder.

<table border="1"><tbody><tr><td> Udstyr / Reagens </td><td> Vendor </td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> Asahi Kasei Rexeed 25 S / R våde hul-fiber ultrafiltre </td><td> Ring Medicinsk </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P 73 (Masterflex R-3603), eller tilsvarende </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex Platinum cured), eller tilsvarende </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96.410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex Platinum cured), eller tilsvarende </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96.410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex Platinum cured), eller tilsvarende </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96.410-36 </td></tr><tr><td> I / P Precision Brushless Drive </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77.410-10 </td></tr><tr><td> I / P Easy Load Pumpehoved </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> Sort HDPE Tee, 1/4 &quot;x 3/8&quot; x 3/8 &quot; </td><td> USA Plast </td><td> 62064 </td></tr><tr><td> Masterflex T-stik L / S 15-25 </td><td> Cole Parmer </td><td> EG-30.613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene heavy-duty pp 1 L flaske </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.257-10 </td></tr><tr><td> 10 ml pipetter </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11C </td></tr><tr><td> Nalgene fyld / udluftningshætte til 1/4 &quot;slange, 53B </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.258-10 </td></tr><tr><td> Manometer </td><td> Cole Parmer </td><td> A-680-46-10 </td></tr><tr><td> Ligekædet kobling NPT (F), 1/4 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.469-18 </td></tr><tr><td> NPT gren tee, naturlige pp </td><td> Cole Parmer </td><td> A-30.610 til 75 </td></tr><tr><td> Slangeventil klemmer, 1/2 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.833-00 </td></tr><tr><td> Custom pasform DIN adaptere </td><td> Formstøbte produkter Corp </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> Ring stand </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-670B </td></tr><tr><td> Ring stand klemmer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-769-6Q </td></tr><tr><td> Keck rampe clamp, 14mm </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.835-10 </td></tr><tr><td> Natriumpolyfosfat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 305553 </td></tr><tr><td> Natriumthiosulfat-pentahydrat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 72050 </td></tr><tr><td> Antifoam Y-30-emulsion </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> Tween-80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 L Sammenklappelig polyethylen med høj densitet cubitainer </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> Centrifugeres flaskestativ </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250 ml koniske centrifugerør </td><td> Corning </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Engangs tragt </td><td> Cole Parmer </td><td> U-6122-10 </td></tr><tr><td> Vask flaske </td><td> Cole Parmer </td><td> U-06.252-40 </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> Svingende spandrotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> ARIES SX4750 </td></tr><tr><td> Centrifugekurv adaptere til 250 ml koniske rør </td><td> Beckman Coulter </td><td> 349849 </td></tr><tr><td> 200 ul stor boring pipettespidser </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> VacuShield Filter </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5 ml pipetter </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeadsene: Cryptosporidium / Giardia combo kit </td><td> JegDEXX </td><td> 73002 </td></tr><tr><td> 50 ml koniske centrifugerør </td><td> Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Dynal L10 flade sider rør </td><td> IDEXX </td><td> 74003 </td></tr><tr><td> Timer </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-6 magnet </td><td> IDEXX </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 1 ml pipetter </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1,5 ml lav adhæsion mikrocentrifugerør </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 gl pipette &amp; svarende barriere tips </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 ul pipette og tilsvarende barriereegenskaber spidser </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9 tommer Pasteur-pipetter </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-S magnet </td><td> IDEXX</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> Vortex </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Dynabeads rotator mixer </td><td> IDEXX </td><td> 94701 </td></tr><tr><td> Varmeblok </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> Lab Armor perler </td><td> Lab Armor </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> Digitalt termometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> Phosphat-buffer saltvand 1X pH 7,4 (1X PBS) </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> Enkelt Spot dias </td><td> IDEXX </td><td> 30201 </td></tr><tr><td> Dæk glas </td><td> Corning </td><td> 287018 </td></tr><tr><td> EasyStain direkte kit </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 pi pipette og tilsvarende barriereegenskaber spidser </td><td> Gilson </td><td> P10 &amp; DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-Diamidino-2-phenyl indol-dihydrochlorid (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> Klar neglelak </td><td> Fisher Scientific </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34155 </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> Boekel Videnskabelig </td><td> 133000 </td></tr><tr><td> glide varmere </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> Nedsænkning olie, type A ND = 1,515 </td><td> Nikon </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> Nikon 90i mikroskop med DIC kapaciteter </td><td> Nikon </td><td> MBA 77000 </td></tr><tr><td> Plan APO 100X olie mål </td><td> Nikon </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Planlæg Achro 20X </td><td> Nikon </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> FITC-filter </td><td> Nikon </td><td> 96302 </td></tr><tr><td> DAPI-filter </td><td> Nikon </td><td> 96301 </td></tr><tr><td> X-Cite fluorescens illuminator </td><td> Nikon </td><td> 87540 </td></tr><tr><td> Linsepapir </td><td> Nikon </td><td> 76997 </td></tr><tr><td> Biohazard engangspose </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> Biohazard beholder til skarpe genstande </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> 3% hydrogenperoxid </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> Blegemiddel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1952030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34790 </td></tr></tbody></table>

a modified epa method 1623 that uses tangential flow hollow-fiber ultrafiltration and heat dissociation steps to detect waterborne cryptosporidium and giardia spp.

Cryptosporidium og Giardia arter er to af de mest udbredte protozoer, der forårsager vandbårne diarré sygdomsudbrud på verdensplan. For bedre at karakterisere forekomsten af disse patogener, blev EPA metode 1623 udviklet og anvendt til at overvåge niveauer af disse organismer i USA drikkevandsforsyningerne 12. Metoden har tre hoveddele: den første er den prøvekoncentration, hvor mindst 10 L af rå overfladevand filtreres. Organismer og fanget rester derefter elueres fra filteret og centrifugeret for yderligere at koncentrere prøven. Den anden del af fremgangsmåden anvender en immunomagnetisk separation procedure, hvor den koncentrerede vand-prøve påføres immunomagnetiske perler, som specifikt binder til Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster muliggør specifik fjernelse af parasitter fra den koncentrerede debris. Disse (oo) cyster derefter adskilles fra de magnetiske perler med en syre dissociation procedure. Den sidste del af metoden er immunofluorescensfarvning og optælling hvor (oo) cyster anvendes på et dias, farves, og optælles ved mikroskopi. Fremgangsmåden 1623 har fire angivne prøvekoncentration systemer til at fange Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster i vand: Envirochek filtre (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filtre (Pall Corporation), Filta-Max filtre (IDEXX, Westbrook, MA), eller Fortløbende Flow Centrifugering (Haemonetics, Braintree, MA). Imidlertid har Cryptosporidium og Giardia (oo) cyster inddrivelser varierede meget afhængigt af kilden vandet matrix og filtre anvendt 1,14. En ny tangential flow hulfiber-ultrafiltrering (HFUF) er for nylig blevet vist at være mere effektive og mere robust på genvinding Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster fra forskellige vand matricer, og desuden er det billigere end andre kapsel filters og kan koncentrere flere patogener samtidigt 1-3,5-8,10,11. Hertil kommer, viste tidligere undersøgelser af Hill og hans kolleger at HFUF væsentligt forbedret Cryptosporidium oocyster inddrivelser, når sammenlignes direkte med de Envirochek HV filtre 4. Yderligere modifikationer af de eksisterende metoder er også blevet rapporteret at forbedre metoden ydeevne. Erstatte syredissociations procedure med varme dissociation blev vist at være mere effektive til adskillelse Cryptosporidium fra de magnetiske perler i nogle matricer 9,13. Denne protokol beskriver en modificeret metode 1623, der bruger det nye HFUF filtreringssystem med varmen dissociationstrinnet. Brugen af ​​HFUF med denne ændrede metode er et billigere alternativ til de nuværende EPA-metode 1623 filtrering muligheder og giver mere fleksibilitet ved at tillade koncentrationen af ​​flere organismer.

Watch this Scientific Journal Video about A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Denne protokol beskrives anvendelsen af ​​en tangentiel strømning hulfiber-ultrafiltrering prøvekoncentration system og en varme dissociation som alternative trin til påvisning af vandbårne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Og<em&gt; Giardia</em&gt; Arter brug af EPA metode 1623.

En opdateret EPA metode 1623, der bruger Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltrering og Heat dissociationshastigheder trin til Detect Vandbaseret<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Og<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex protokol til DNA-ekstraktion fra<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Høj og lav gennemløb Skærme med rodgallenematoder Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Locked Nucleic Acid Flowcytometri-fluorescens In situ Hybridisering (LNA flow-FISH): En metode til bakteriel små RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

Glas Uld Filtre til at koncentrere Vandbårne Virus og landbrugsskoler zoonotiske patogener

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

En enkel og effektiv metode til at påvise Nuclear Factor Aktivering i humane neutrofiler ved flowcytometri

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-baserede Flowcytometri Teknik at vurdere ændringer i granulocyt Function<em&gt; In vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel og hurtig protokol til ikke-enzymatisk dissociere frisk humant væv til analyse af lymfocytter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

En reference Broth mikrofortynding Metode til dalbavancin<em&gt; In vitro</em&gt; Resistensbestemmelse af bakterier, der vokser aerobt

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

A Simple flowcytometriske metode til at måle glukoseoptagelse og Glucose Transporter Udtryk for Monocyt undergrupper i fuldblod

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...