Name: using the blt humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model
Uploaded: 2012-12-18T12:00:00
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Gostaríamos de agradecer Alvin Welch e Larry Pang para a sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) prêmio P50 CA086306, o Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) subvenções RC1-00149-1 e RS1-00203-1; CIRM Prêmio Nova Faculdade RN2-00902-1 , o Caltech-UCLA Centro Conjunto de Translational Medicine, UCLA Center for AIDS Research (CFAR) NIH / NIAID AI028697, a UCLA Aids Institute, as ferramentas CIRM e Prêmio Tecnologia RT1-01126, ea UC Programa de Pesquisa multicampus e Iniciativas da Califórnia Centro de antiviral Drug Discovery (número MRPI-143226).

A. Geração de ratos BLT A geração de ratinhos BLT é dividido em três (3) partes: (1) de processamento de tecido fetal e preparação de CD34 humano de células-tronco hematopoiéticas, (2) transplante de tecido humano, e (3) transplantação secundária. Para todos os protocolos, fornecemos Tabela 1 com os dados de reagente. 1. Processamento de tecidos e Isolamento de CD34 Células-Tronco Hematopoéticas Tecido fetal...

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	<li>McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCID-hu+mouse:+murine+model+for+the+analysis+of+human+hematolymphoid+differentiation+and+function.">The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function.</a> Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).</li><li>Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+maintenance+of+SCID-hu+mice+for+HIV+research.">Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research.</a> Methods. 12 (4), 343-347 (1997).</li><li>Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+a+functional+human+immune+system+to+mice+with+severe+combined+immunodeficiency.">Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency.</a> Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).</li><li>Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1.">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li><li>Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+pre-exposure+prophylaxis+prevents+vaginal+transmission+of+HIV-1+in+humanized+BLT+mice.">Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice.</a> PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).</li><li>Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarectal+transmission,+systemic+infection,+and+CD4++T+cell+depletion+in+humanized+mice+infected+with+HIV-1.">Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1.</a> J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).</li><li>Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+short+hairpin+RNA+potently+down-regulates+CCR5+expression+in+systemic+lymphoid+organs+in+the+hu-BLT+mouse+model.">A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model.</a> Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).</li><li>V, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+HIV+Latency+in+Humanized+BLT+Mice.">Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice.</a> J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).</li><li>Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+from+antigen-specific+CD8+T+cells+generated+in+vivo+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells.">Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).</li></ol>

O modificado BLT modelo de rato humanizado juntamente com in vivo PET são ferramentas poderosas para estudar doenças crônicas humanos. Este sistema tem o modelo do rato BLT e avança para além do escopo limitado para pesquisa do HIV. Além disso, é um excelente sistema em que podemos examinar diversos protocolos de terapia de genes, bem como técnicas de diagnóstico, antes de poderem atingir o ambiente clínico. Este último acoplado com o baixo custo do uso de ratos contra os primatas torna este modelo m...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> A1049101 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove </td><td></td><td> 12440061 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td></td><td> 16000085 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase tipo IV </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> Hialuronidase </td><td></td><td> H3506 </td><td></td></tr><tr><td> DNAse I </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10104159001 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Piptazo (Zosyn) </td><td> Pfizer </td><td></td><td> <a href="http://labeling.pfizer.com/showlabeling.aspx?id=416" target="_blank">Piperacilina / tazobactam combinação</a> </td></tr><tr><td> Ficoll (Ficoll-Paque Plus) </td><td> GE Healthcare Life Sciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> MACS buffer </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> Veja os comentários </td><td> MACS tampão: PBS suplementado com 0,5% de soro fetal bovino e 2 mM de citrato dextrose fórmula-A </td></tr><tr><td> CD34 microbead Kit </td><td></td><td> 130-046-702 </td><td></td></tr><tr><td> Colunas LS </td><td></td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> Retronectin </td><td> Takara </td><td> T100A </td><td></td></tr><tr><td&gt; Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354263 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluorano </td><td> Baxter </td><td></td><td> <a href="http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html" target="_blank">http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html</a> </td></tr><tr><td> Carprofeno (Rimadyl) </td><td> Pfizer Saúde Animal </td><td></td><td> <a href="https://www.rimadyl.com/default.aspx" target="_blank">https://www.rimadyl.com/default.aspx</a> </td></tr></tbody></table>

using the blt humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model

Modelos de pequenos animais, como ratos têm sido amplamente utilizados para estudar a doença humana e ao desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas. Apesar da riqueza de informação obtida a partir destes estudos, as características únicas de imunidade do rato, assim como a especificidade de espécie de doenças virais, tais como o vírus da imunodeficiência humana (HIV), levou ao desenvolvimento de modelos de ratinhos humanizados. Os modelos anteriores envolveram a utilização de C. B 17 scid / scid ratos e o transplante de timo fetal humano e de fígado fetal denominados tua / liv (SCID-hu) 1, 2 ou a transferência adoptiva de leucócitos do sangue periférico humano (huPBL-IDCG ) 3. Ambos os modelos foram utilizados principalmente para o estudo da infecção por HIV. Uma das limitações principais de ambos os modelos foi a falta de reconstituição estável de células imunitárias na periferia para torná-los um modelo mais fisiologicamente relevante para estudar a doença de HIV. Para este fim, o zumbido BLTmodelo do rato anized foi desenvolvido. BLT significa medula óssea / fígado / timo. Neste modelo, de 6 a 8 semanas de idade NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SZJ (NSG) ratinhos imunocomprometidos receber o implante tua / liv como no modelo de ratinho SCID-hu apenas a ser seguido por um segundo transplante de células-tronco hematopoiéticas humanas 4. A vantagem deste sistema é a reconstituição completa do sistema imune humano na periferia. Este modelo foi utilizado para estudar a infecção por HIV e de latência 5-8. Nós geramos uma versão modificada do modelo em que usamos geneticamente modificados células-tronco hematopoiéticas (HHSC) para construir o implante teu / liv seguido de injeção de transduzidas autólogo HHSC 7, 9. Esta abordagem resulta na geração de linhagens geneticamente modificados. Mais importante ainda, adaptou-se este sistema para examinar o potencial de gerar funcionais As células T citotóxicas (CTL) que expressam um receptor de melanoma de células T específico. Usando esse modelo, pudemos avaliar a funcionalidade do nosso CTL transgênico vivo utilizando tomografia por emissão de tomografia (PET) para determinar a regressão do tumor (9). O objetivo deste protocolo é o de descrever o processo de gerar esses camundongos transgênicos e avaliação de eficácia in vivo utilizando imagens de PET ao vivo. Como uma nota, uma vez que usamos tecidos humanos e vetores lentivirais, nossas instalações estão em conformidade com as diretrizes do CDC NIH para o Nível de Biossegurança 2 (BSL2) com precauções especiais (BSL2 +). Além disso, os ratos do NSG são severamente imunocomprometidos, assim, a sua habitação e manutenção devem estar de acordo com os mais elevados padrões de saúde ( <a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a> ).

Um diagrama de fluxo do processo de transplante é mostrado na Figura 1A. Uma imagem do implante teu / liv é mostrado na Figura 1B. O tecido tímico desenvolve normalmente e tem uma distribuição fisiológica de CD4 humano e células T CD8. Após a reconstituição, os animais carregam um sistema imune humano com distribuição normal de CD4, CD8, células T e outras linhagens de células imunes. A discrepância entre o tamanho do tumor e do tecido vivo é...

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Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

A geração e caracterização de células T específicas de tumor utilizando ratinhos humanizados é descrita aqui. Tecido do timo humano e geneticamente modificadas de células-tronco hematopoiéticas são transplantadas em ratos imunocomprometidos. Isto resulta na reconstituição de um sistema imune humano permitindo engenharia para exame in vivo de anticorpos anti-tumorais respostas imunes.

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Imunologia e Infecção

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

As células T de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o Sistema de captura de citocinas

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organóides como modelo para Doenças Infecciosas: Cultura dos Direitos Humanos e Organóides e estômago murino Microinjection do Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Um ensaio baseado em CFSE para estudar a migração de Murino pele as células dendríticas em drenagem gânglios linfáticos durante a infecção com<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...