Name: using the blt humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model
Uploaded: 2012-12-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model at JoVE.com

Vi vill tacka Alvin Welch och Larry Pang för deras hjälp. Detta arbete har finansierats delvis av National Institutes of Health (NIH) utmärkelse P50 CA086306, California Institute för regenerativ medicin (CIRM) beviljar RC1-00.149-1 och RS1-00.203-1, CIRM ny fakultet Award RN2-00.902-1 , Caltech-UCLA gemensamma Centrum för translationell medicin, UCLA Center för AIDS-forskning (CFAR) NIH / NIAID AI028697, UCLA AIDS Institute, de CIRM verktyg och teknik Award RT1-01.126, och UC Multicampus för forskning och initiativ från California Centrum för antivirala läkemedel Discovery (antal MRPI-143.226).

A. Generering av BLT möss Generering av BLT möss är uppdelad i tre (3) delar: (1) behandling av fostervävnad och beredning av CD34 humana hematopoetiska stamceller, (2) Transplantation av mänskliga vävnader, och (3) sekundär transplantation. För alla protokoll, har vi tillhandahållit Tabell 1 med reagens information. 1. Vävnadsbehandling och isolering av CD34 humana hematopoietiska stamceller Färska fostervävna...

<ol>
	<li>McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SCID-hu+mouse:+murine+model+for+the+analysis+of+human+hematolymphoid+differentiation+and+function.">The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function.</a> Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).</li><li>Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+maintenance+of+SCID-hu+mice+for+HIV+research.">Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research.</a> Methods. 12 (4), 343-347 (1997).</li><li>Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+a+functional+human+immune+system+to+mice+with+severe+combined+immunodeficiency.">Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency.</a> Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).</li><li>Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1.">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li><li>Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+pre-exposure+prophylaxis+prevents+vaginal+transmission+of+HIV-1+in+humanized+BLT+mice.">Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice.</a> PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).</li><li>Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarectal+transmission,+systemic+infection,+and+CD4++T+cell+depletion+in+humanized+mice+infected+with+HIV-1.">Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1.</a> J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).</li><li>Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+short+hairpin+RNA+potently+down-regulates+CCR5+expression+in+systemic+lymphoid+organs+in+the+hu-BLT+mouse+model.">A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model.</a> Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).</li><li>V, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+HIV+Latency+in+Humanized+BLT+Mice.">Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice.</a> J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).</li><li>Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+from+antigen-specific+CD8+T+cells+generated+in+vivo+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells.">Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).</li></ol>

Den modifierade BLT humaniserade musmodell tillsammans med in vivo PET imaging är kraftfulla verktyg för att studera kroniska sjukdomar hos människor. Detta system tar BLT musmodellen och förskott det utöver den begränsade räckvidden för HIV-forskning. Dessutom är det ett bra system där vi kan undersöka olika genterapiprotokoll samt diagnostiska tekniker innan de kan nå den kliniska miljön. Den senare är kopplad med den låga kostnaden för att använda möss kontra primater gör detta till en myc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> A1049101 </td><td></td></tr><tr><td> Iscoves </td><td></td><td> 12440061 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt kalvserum </td><td></td><td> 16000085 </td><td></td></tr><tr><td> Typ IV-kollagenas </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> Hyaluronidas </td><td></td><td> H3506 </td><td></td></tr><tr><td> DNas I </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10104159001 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Piptazo (Zosyn) </td><td> Pfizer </td><td></td><td> <a href="http://labeling.pfizer.com/showlabeling.aspx?id=416" target="_blank">Piperacillin / tazobaktam kombination</a> </td></tr><tr><td> Ficoll (Ficoll-Paque Plus) </td><td> GE Healthcare Life Sciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> MACS Buffert </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> Se kommentarer </td><td> MACS buffert: PBS kompletterad med 0,5% fetalt bovint serum och 2 mM citrat dextros formeln-A </td></tr><tr><td> CD34 mikrokorn Kit </td><td></td><td> 130-046-702 </td><td></td></tr><tr><td> LS kolumner </td><td></td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> Retronectin </td><td> Takara </td><td> T100A </td><td></td></tr><tr><td&gt; Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354.263 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluoran </td><td> Baxter </td><td></td><td> <a href="http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html" target="_blank">http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html</a> </td></tr><tr><td> Karprofen (Rimadyl) </td><td> Pfizer Animal Health </td><td></td><td> <a href="https://www.rimadyl.com/default.aspx" target="_blank">https://www.rimadyl.com/default.aspx</a> </td></tr></tbody></table>

using the blt humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model

Små djurmodeller såsom möss har i stor utsträckning använts för att studera mänskliga sjukdomar och att utveckla nya terapeutiska interventioner. Trots den stora mängd information som vunnits från dessa studier ledde de unika egenskaperna hos mus immunitet samt artspecificitet av virussjukdomar såsom humant immunbristvirus (HIV) till utveckling av humaniserade musmodeller. De tidigare modellerna involverade användningen av C. B 17 scid / scid möss och transplantation av humana fetala tymus och kallas foster lever din / liv (SCID-hu-) 1, 2 eller adoptiv överföring av humana perifera blodleukocyter (SCID-huPBL ) 3. Båda modellerna huvudsakligen används för att studera HIV-infektion. En av de viktigaste begränsningarna hos båda dessa modeller var bristen på stabila rekonstitution av humana immunceller i periferin för att göra dem mer fysiologiskt relevant modell för att studera HIV-sjukdom. För detta ändamål BLT humanized musmodell utvecklades. BLT står för benmärg / lever / tymus. I denna modell 6 till 8 veckor gamla NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) nedsatt immunförsvar möss får din / liv implantat som i SCID-hu-musmodell bara för att följas av en andra human hematopoetisk stamcellstransplantation 4. Fördelen med detta system är den fullständiga rekonstitution av det humana immunsystemet i periferin. Denna modell har använts för att studera HIV-infektion och latens 5-8. Vi har skapat en modifierad version av denna modell som vi använder genetiskt modifierade humana hematopoetiska stamceller (hHSC) att bygga din / liv implantat följt av injektion av transducerade autologa hHSC 7, 9. Detta tillvägagångssätt resulterar i genereringen av genetiskt modifierade linjerna. Ännu viktigare, anpassade vi detta system för att undersöka potentialen att generera funktionella cytotoxiska T-celler (CTL) som uttrycker en melanom specifik T-cellreceptor. Med hjälp av denna modell kunde vi bedöma funktionaliteten hos vår transgen CTL använder levande positronemissionstomografi (PET) avbildning för att bestämma tumörregression (9). Målet med detta protokoll är att beskriva processen att skapa dessa transgena möss och bedöma effektivitet in vivo med levande PET imaging. Som en anteckning, eftersom vi använder mänskliga vävnader och lentivirusvektorer, våra anläggningar uppfyller CDC NIH riktlinjer för biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) med särskilda försiktighetsåtgärder (BSL2 +). Dessutom är NSG mössen allvarligt nedsatt immunförsvar så måste deras boende och underhåll uppfyller de högsta hälsonormer ( <a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a> ).

Ett flödesschema av transplantationen processen visas i figur 1A. En bild av THY / LIV implantat visas i figur 1B. Tymusvävnaden utvecklas normalt och har en fysiologisk fördelning av humana CD4 och CD8 T-celler. Efter beredning djuren bär ett mänskligt immunförsvar med normal fördelning av CD4, CD8 T-celler och andra immun härstamningar cell. Skillnaden mellan tumörstorlek och levande vävnad visas i figur 2. Medan datortomografi (...

Watch this Scientific Journal Video about Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model at JoVE.com

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Alstringen och karakterisering av tumörspecifika T-celler med användning av humaniserade möss beskrivs här. Human tymusvävnad och genetiskt modifierade humana hematopoetiska stamceller transplanteras till nedsatt immunförsvar möss. Detta resulterar i att rekonstituera en manipulerad mänskliga immunsystemet möjliggör in vivo-undersökning av anti-tumör immunsvar.

Använda BLT Humaniserad Pigg som en stamcell baserad genterapi tumörmodell

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generering av Multivirus-specifika T-celler för att förhindra / behandla virusinfektioner efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Expanderande Cytotoxiska T-lymfocyter från navelsträngsblod att Target cytomegalovirus, Epstein-Barr-virus, och adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion av transplantat-mot-värd-sjukdom och<em&gt; In Vivo</em&gt; T cell övervakning med en MHC-matchade musmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cell-baserade flödescytometri analys för att mäta cytotoxisk aktivitet

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humaniserad musmodell för att studera bakterieinfektioner Inriktning mikrovaskulaturen

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Automatiserad cell Anrikning av cytomegalovirus-specifika T-celler för kliniska tillämpningar med hjälp av cytokin-infångningssystemet

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids som modell för Infektionssjukdomar: Culture of Human och Murina mage Organoids och mikroinjektion av Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flödescytometri-baserad analys för övervakning av NK cellfunktioner

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

En CFSE-baserad analys för att studera migration av dendritiska Murin hudceller i dränerande lymfkörtlar under infektion med<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guerin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...