Name: an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice
Uploaded: 2012-08-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

De auteurs willen graag Catherine Alford bedanken voor suggesties op cel dissociatie methoden en Kevin Weller, David Flaherty en Bretagne Matlock voor steun in de flowcytometrie gedeelde bron aan de Vanderbilt University Medical Center en Melissa A. Musser voor artistieke hulp bij illustraties. Wij danken Drs. Jack Mosher en Sean Morrison voor advies over de uitvoering van isolatie van neuronale voorlopercellen. De VMC flowcytometrie gedeelde bron wordt ondersteund door de Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) en de Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404). Dit werk werd ondersteund door de financiering van de Amerikaanse National Institutes of Health subsidies DK064251, DK086594 en DK070219.

1. Voorbereiding van de Media (Alle stappen gedaan in weefselkweek kap) <ol><li> Meng de volgende: 44 ml L-15 gemiddeld, 0,5 ml 100X penicilline / streptomycine (P / S), 0,5 ml 100 mg / ml runderserumalbumine (BSA), 0,5 ml 1 M HEPES, 5 ml weefselkweek bestemde water. Zorg ervoor dat u goed te mengen BSA en P / S voor het toevoegen. Dit volume is geschikt voor de dissociatie van maximaal vijf verschillende weefsels types. Deze media worden gebruikt in stap 3,4 tot afkoeling van oplossingen voor te bereiden op het gebru...

<ol>
	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

Muis reporter lijnen uitdrukken TL-verslaggevers zijn steeds op grote schaal beschikbaar via diverse inspanningen in het muizen genetica gemeenschap 1,8,9. Als gevolg van de dissociatie methode hier weergegeven kan breed worden toegepast voor het isoleren van discrete neuronale subtypes op neurotransmitters of receptor expressiepatronen van een foetaal of volwassen weefsels. Hoewel we deze methode geoptimaliseerd op basis van de expressie van een transgen fluorescerende reporter kan ook worden toegepast op mo...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens Naam </td><td> Verkoper </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Sigma (MFR: Innovatieve Cell Technologies) </td><td> A7089-100ML </td><td> Bewaar bevroren in 1 ml monsters </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D-4527 </td><td> Opgeslagen ingevroren bij -20 ° C 5 mg / ml in 1xHBSS, (Gebruikt in Quench, Quench 1:5) </td></tr><tr><td> 10X PBS pH 7,4 </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> Vul aan 1x met weefselkweek bestemde water dan steriele filter </td></tr><tr><td> 10X HBSS w / o Ca of Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> Vul aan 1x met weefselkweek bestemde water dan steriele filter </td></tr><tr><td> Leibovitz&#39;s L-15-medium </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine 100X </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> Store hoeveelheden verdeeld bij -20 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-100G </td><td> Bewaar hoeveelheden verdeeld bij -20 ° C, 100 mg / ml in water </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M HEPES in 0,85% NaCl </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 micrometer NITEX Nylon Mesh Membraan </td><td> Sefar Amerika </td><td> 3-38/22 </td><td> Snijd in ~ 3 cm vierkantjes. UV-behandeling &#39;s nachts te steriliseren in de weefselkweek kap. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml polystyreen buizen </td><td> Valk </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml conische buizen </td><td> Corning </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> Fijn ontleden tang </td><td> Fijn wetenschappelijke instrumenten </td><td> 11251-30 </td><td> Dumont # 5 forcep, Dumoxel, standaard tip 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> Het ontleden van Spoon </td><td> Fijn wetenschappelijke instrumenten </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

Tijdens de ontwikkeling neurale lijst (NC)-afgeleide neurale voorlopercellen weg te migreren van de neurale buis op autonome ganglia vormen in viscerale organen zoals de darm en de lagere urinewegen. Zowel tijdens de ontwikkeling als in volwassen weefsels deze cellen worden vaak op grote schaal verspreid over weefsels, zodat isolatie van discrete populaties met behulp van methoden zoals laser capture micro-dissectie moeilijk is. Ze kunnen echter direct worden gevisualiseerd door de expressie van fluorescerende verslaggevers aangedreven door regulerende gebieden van neuron-specifieke genen, zoals Tyrosine hydroxylase (TH). Wij beschrijven een werkwijze geoptimaliseerd voor een hoog rendement van levensvatbare TH + neuronale voorlopers van foetale muis inwendige weefsels inclusief darm en lagere urogenitale (LUT), gebaseerd op dissociatie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). De Th-gen codeert voor het snelheidsbepalende enzym voor de productie van catecholamines. Enteric neuronale voorlopercellen beginnen TH tijdens drukkenIng hun migratie in de foetale darm 1 en TH is ook aanwezig in een subgroep van de volwassen bekken ganglia neuronen 2-4. De eerste verschijning van deze lijn en de verdeling van deze neuronen in andere aspecten van de LUT, en hun isolement is niet beschreven. Neuronale voorouders uiten TH kan gemakkelijk worden gevisualiseerd door de expressie van EGFP in muizen die het transgen construct Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. We afgebeeld uitdrukking van dit transgen in foetale muizen om de verdeling van de TH + cellen te documenteren in de ontwikkelingslanden LUT op 15,5 dagen na de coïtus (DPC), de aanwijzing van de ochtend van plug detectie voor 0,5 dpc, en merkte op dat een subset van neuronale voorlopercellen in het samenvoegen bekken ganglia express EGFP. Om LUT TH + neuronale voorlopercellen te isoleren, hebben we geoptimaliseerde methoden die in eerste instantie werden gebruikt om de neurale lijst stamcellen uit foetaal muis darm 2-6 te zuiveren. Voorafgaand inspanningen om NC-afgeleide bevolking vertrouwd te isolerenknippen met een cocktail van collagenase en trypsine om celsuspensies te verkrijgen voor flowcytometrie. In onze handen deze methoden celsuspensies uit de LUT met relatief lage levensvatbaarheid. Gezien de al lage incidentie van neuronale voorlopercellen in foetale LUT weefsels, we wilden dissociatie methoden zodanig dat overleving van de cel in de laatste distantieert zou worden verhoogd optimaliseren. We hebben vastgesteld dat zachte dissociatie in Accumax (innovatieve Cell Technologies, Inc), handmatig filteren, sorteren en de stroom bij lage druk liet ons toe om steeds grotere overleving (&gt; 70% van het totaal cellen) bereiken met latere opbrengst van de neuronale voorlopercellen voldoende voor downstream-analyse. De methode beschreven kunnen ruwweg worden toegepast om een ​​verscheidenheid van neuronale populaties isoleren van een foetus of volwassen muizen weefsels.

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Een geoptimaliseerde procedure om neurale lijst afgeleide neuronale voorlopercellen uit foetaal weefsel muis te zuiveren wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van expressie van fluorescerende reporter allelen van discrete populaties isoleren door middel van fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS). De techniek kan worden toegepast neuronale subpopulaties isoleren door ontwikkeling of volwassen weefsels.

Een geoptimaliseerde Procedure voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) Isolatie van autonome neurale voorlopercellen uit viscerale organen van de foetus Muizen

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neurale-Colony Forming Cell-test: Een test om Bona Fide neurale stamcellen van Neural Progenitor Cellen Discrimineer

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Generatie van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale Cortical weefsel

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Celsortering van neurale stamcellen en stamcellen uit de Adult Mouse subventriculaire zone en Live-beeldvorming van de celcyclus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) en genexpressie analyse van Fos expressie neuronen van verse en diepgevroren Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primaire cel cultuur van gezuiverde erge of glutamaterge neuronen opgericht door fluorescentie-geactiveerde cel sorteren

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...