Name: an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice
Uploaded: 2012-08-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות קתרין אלפורד לקבלת הצעות על התא דיסוציאציה שיטות וקווין ולר, דוד פלאהרטי ואת בריטני מטלוק על התמיכה ב משאבים תזרים Cytometry משותף באוניברסיטת ונדרבילט מרכז רפואי ומליסה א Musser לסיוע אמנותי עם איורים. אנו מודים בני הזוג. ג&#39;ק מושר ושון מוריסון עצה יישום הבידוד של אבות עצביים. תזרים VMC Cytometry המשאב המשותף הוא נתמך על ידי אינגרם ונדרבילט במרכז לחקר הסרטן (p30 CA68485) לבין מחלות העיכול ונדרבילט מרכז המחקר (p30 DK058404). עבודה זו נתמכה על ידי ארה&quot;ב במימון מכוני הבריאות הלאומיים מענקים DK064251, DK086594, ו DK070219.

1. הכנת מדיה (כל השלבים נעשה מכסה המנוע בתרבית רקמה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב הבא: 44 מ&quot;ל L-15 בינוני, 0.5 מ&quot;ל 100x פניצילין / סטרפטומיצין (P / S), 0.5 מ&quot;ל 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​שור סרום אלבומין (BSA), 0.5 HEPES מ&quot;ל 1M, 5 רקמות מ&quot;ל מים תרבות כיתה. יש להקפיד ?...

<ol>
	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

הכתב עכבר קווים המבטאים כתבים ניאון הופכים להיות זמינים באופן נרחב באמצעות מאמצים מרובים Murine גנטיקה הקהילה 1,8,9. כתוצאה מכך שיטת ניתוק מאויר כאן יכולים להיות מיושמים באופן נרחב על בידודו של תת נוירונים בדידים המבוססים על עצבי או ביטוי דפוסי הקולטן מ משני רקמות ?...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב שם </td><td> מוכר </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> סיגמא (המימון המינימלי הנדרש: התא טכנולוגיות חדשניות) </td><td> A7089-100 מ&quot;ל </td><td> אחסן קפוא 1 aliquots מ&quot;ל </td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> סיגמא </td><td> D-4527 </td><td> מאוחסן קפוא ב -20 ° C 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב 1xHBSS, (משמש להרוות, תכבו 01:05) </td></tr><tr><td> PH 7.4 10X PBS </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> לעשות עד 1x במים תרבות רקמות כיתה ואז מסנן סטרילי </td></tr><tr><td> 10X HBSS W / O CA או Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> לעשות עד 1x במים תרבות רקמות כיתה ואז מסנן סטרילי </td></tr><tr><td> ליבוביץ של L-15 בינוני </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין 100x </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> חנות aliquoted ב -20 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא </td><td> A3912-100 גרם </td><td> אחסן aliquoted ב -20 ° C, 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במים </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M HEPES ב NaCl 0.85% </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 מיקרומטר NITEX ניילון קווי ממברנה </td><td> Sefar אמריקה </td><td> 3-38/22 </td><td> חותכים ~ 3 ריבועים ס&quot;מ. UV לטיפול לילה לעקר בשכונה בתרבית רקמה. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל צינורות קלקר </td><td> בז </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל </td><td> קורנינג </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים המבתרים יפות </td><td> המדע מכשירים דקים </td><td> 11251-30 </td><td> דומון # 5 Forcep, Dumoxel, רמת עצה 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> לנתח את כף </td><td> המדע מכשירים דקים </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

במהלך ההתפתחות העצבית לפסגה (NC) הנגזרות אבות נוירונים נודדים מן הצינור העצבי ליצירת הגרעינים האוטונומית באיברים כמו המעי בטן ועל דרכי השתן התחתונות. הן במהלך פיתוח ברקמות בוגרים תאים אלה הם לעתים קרובות מפוזרים באופן נרחב בכל הרקמות, כך בידוד אוכלוסיות נפרדות באמצעות שיטות כמו לכידת לייזר מיקרו לנתיחה קשה. הם יכולים עם זאת דמיינו ישירות על ידי הביטוי של עיתונאים המונעים על ניאון מאזורים הרגולציה של נוירון גנים ספציפיים כמו hydroxylase טירוזין (ה &#39;). אנו מתארים את שיטת אופטימיזציה עבור תשואות גבוהות של TH + קיימא אבות עצביים מרקמות העכבר בטן העובר, כולל המעי בדרכי המין ודרכי השתן התחתונה (LUT), המבוסס על דיסוציאציה הקרינה המופעל מיון תאים (FACS). ה &#39;הגן המקודד את האנזים מגביל את שיעור לייצור catecholamines. אבות עצביים אנטרי מתחילים להביע TH durלאינג ההגירה שלהם במעי העובר 1 ו TH נוכחת גם משנה של נוירונים בוגרים הגרעינים האגן 2-4. ההופעה הראשונה של שושלת זו לבין חלוקת נוירונים אלה בהיבטים אחרים של LUT, ובידוד שלהם לא תוארה. אבות נוירונים המבטאים TH ניתן דמיינו בקלות על ידי ביטוי EGFP בעכברים נושאי מבנה transgene Tg (TH-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. אנחנו צילמו ביטוי transgene זה בעכברים עובריים כדי לתעד את חלוקת TH + תאים LUT פיתוח ב 15.5 ימים שלאחר משגל (DPC), מייעדים הבוקר של זיהוי plug כמו 0.5 DPC, ו ציין כי תת קבוצה של אבות העצבית התגבשו האגן הגרעינים אקספרס EGFP. לבודד TH + LUT אבות עצביים, אנו אופטימיזציה שיטות ששימשו בתחילה לטהר גזע עצביים לפסגה תאים מהמעי העכבר העובר 2-6. מאמצים קודמים לבודד NC-derived אוכלוסיות לסמוך עלעיכול עם קוקטייל של collagenase ו טריפסין להשיג השעיות התא עבור cytometry הזרימה. בידינו שיטות אלה מיוצרים השעיות סלולריים מ LUT עם כדאיות נמוכה יחסית. לאור השכיחות הנמוכה ממילא של אבות עצביים ברקמות העובר LUT, יצאנו כדי לייעל את שיטות ניתוק כאלה הישרדות התא של dissociates האחרונים היה להיות מוגברת. קבענו כי ניתוק עדינה Accumax (התא טכנולוגיות חדשניות, Inc), הוראות סינון, מיון וזרימה בלחצים נמוכים אפשרה לנו להשיג שרידות גבוהה יותר באופן עקבי (&gt; 70% של תאים הכולל של הפורום) עם תשואות הבאות של אבות עצביים מספיקים לניתוח במורד הזרם. שיטת הפעולה המתואר יכול להיות מיושם באופן כללי לבודד מגוון של אוכלוסיות נוירונים מ משני Murine רקמות עובריות או מבוגר.

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

הליך אופטימיזציה לטהר עצביים לפסגה הנגזרות אבות עצביים מרקמות העכבר העובר מתוארת. שיטה זו מנצלת את הביטוי של אללים הכתב ניאון לבודד אוכלוסיות נפרדות על ידי מיון הקרינה המופעל תאים (FACS). הטכניקה ניתן ליישם על מנת לבודד subpopulations עצביים לאורך ההתפתחות או ברקמות בוגרים.

נוהל אופטימליים עבור Fluorescence המופעל בידוד מיון (FACS) תא של אבות עצביות האוטונומית מאיברים בטן של עכברים עוברית

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

רקמות קרינה הופעלו מיון תאים (FACS) וניתוח ביטוי גנים של נוירונים Fos להביע מ טרי קפוא מוח החולדה

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

התא הראשי תרבות של מטוהרים GABAergic או Glutamatergic נוירונים הוקמה באמצעות מיון תאים פלואורסצנטית מופעל

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...