Name: an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice
Uploaded: 2012-08-17T13:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare Catherine Alford per suggerimenti su metodi di dissociazione cellulare e Kevin Weller, David Flaherty e Bretagna Matlock per il supporto nel Resource Citometria a Flusso in comune presso la Vanderbilt University Medical Center e Melissa A. Musser per l&#39;assistenza artistica con illustrazioni. Ringraziamo Drs. Jack Mosher e Sean Morrison per consigli sulla realizzazione di isolamento dei progenitori neuronali. Il VMC Resource Citometria a Flusso in comune è sostenuta dalla Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) e la Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404). Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento da US National Institutes of sovvenzioni Salute DK064251, DK086594 e DK070219.

1. Preparazione di Media (Tutte le fasi fatto in cappa di coltura di tessuti) <ol><li> Combina il seguente: 44 L-15 ml media, 0,5 ml 100X penicillina / streptomicina (P / S), 0,5 ml 100 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA), 0,5 ml HEPES 1M, 5 ml di acqua Tissue Culture Grade. Assicurarsi di mescolare BSA e P / S bene prima di aggiungere. Questo volume dovrebbe essere adeguato per la dissociazione di un massimo di cinque tipi diversi tessuti. Questo supporto sarà utilizzato nel passaggio 3,4 per preparare le soluz...

<ol>
	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

Linee giornalista del mouse che esprimono giornalisti fluorescenti sono sempre ampiamente disponibili attraverso molteplici sforzi nella genetica murina comunità 1,8,9. Come risultato il metodo dissociazione illustrato qui può essere ampiamente utilizzato per l&#39;isolamento di distinti sottotipi neuronali basato su neurotrasmettitore o pattern di espressione del recettore da entrambi i tessuti fetali o adulto. Mentre ci sono ottimizzate questo metodo basato su espressione di un reporter fluorescente trans...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente Nome </td><td> Venditore </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Sigma (MFR: Cell Technologies innovative) </td><td> A7089-100ML </td><td> Conservare congelato in aliquote da 1 ml </td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Sigma </td><td> D-4527 </td><td> Conservati congelati a -20 ° C 5 mg / ml in 1xHBSS, (Usato in Quench, Quench 01:05) </td></tr><tr><td> 10X PBS pH 7,4 </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> Portare a 1x con acqua grado coltura tissutale poi filtrare sterile </td></tr><tr><td> 10X HBSS w / o Ca o Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> Portare a 1x con acqua grado coltura tissutale poi filtrare sterile </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina 100X </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> Conservare aliquote a -20 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-100G </td><td> Conservare aliquote a -20 ° C, 100 mg / ml in acqua </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M in HEPES 0,85% NaCl </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 micron NITEX Nylon Mesh Membrane </td><td> Sefar l&#39;America </td><td> 3-38/22 </td><td> Tagliare a ~ 3 cm quadrati. UV trattare durante la notte a sterilizzare in cappa coltura tissutale. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml in polistirolo tubi </td><td> Falco </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> Provette da 15 ml coniche </td><td> Corning </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> Belle dissettore </td><td> Strumenti scientifici Belle </td><td> 11251-30 </td><td> Dumont # 5 forcep, Dumoxel, standard punta 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> Dissezione Spoon </td><td> Strumenti scientifici Belle </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

Durante lo sviluppo cresta neurale (NC) di derivazione progenitori neuronali migrano dal tubo neurale per formare gangli autonomo negli organi viscerali come l&#39;intestino e delle basse vie urinarie. Sia durante lo sviluppo e nei tessuti maturi queste cellule sono spesso disperse in tutta tessuti in modo che l&#39;isolamento delle popolazioni discrete mediante metodi come la cattura laser micro-dissezione è difficile. Possono comunque essere visualizzati direttamente tramite l&#39;espressione di giornalisti fluorescenti guidati da regioni regolatorie dei geni specifici neuroni, come la tirosina idrossilasi (TH). Noi descriviamo un metodo ottimizzato per alte rese di + TH vitale progenitori neuronali da tessuti di topo fetali viscerali, inclusi intestino e inferiore del tratto urogenitale (LUT), basata su fluorescenza dissociazione e selezione delle cellule attivate (FACS). Il gene codifica per la Th enzima limitante per la produzione di catecolamine. Enterici progenitori neuronali cominciano a esprimere TH durcorso del loro migrazione nell&#39;intestino fetale 1 e TH è anche presente in un sottoinsieme di adulti neuroni gangli pelvico 2-4. La prima comparsa di questa linea e la distribuzione di questi neuroni in altri aspetti della LUT, e il loro isolamento non è stata descritta. Progenitori neuronali che esprimono TH possono essere facilmente visualizzati tramite espressione di EGFP in topi portatori del transgene costrutto Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Abbiamo ripreso espressione di questo transgene nei topi fetali per documentare la distribuzione dei TH + celle nella LUT sviluppando a 15,5 dopo il coito giorni (DPC), che designa la mattina del rilevamento Plug come 0,5 DPC, e ha osservato che un sottoinsieme di progenitori neuronali nel coalescenza pelvica gangli express EGFP. Per isolare LUT TH + progenitori neuronali, abbiamo ottimizzato metodi che sono stati inizialmente utilizzati per purificare le cellule della cresta neurale staminali da intestino del mouse fetale 2-6. Sforzi precedenti per isolare NC-derivati ​​popolazioni invocatidigestione con un cocktail di collagenasi e tripsina per ottenere sospensioni cellulari per citometria a flusso. Nelle nostre mani questi metodi di sospensioni di cellule prodotte dal LUT con la vitalità relativamente bassa. Data la già bassa incidenza dei progenitori neuronali nei tessuti fetali LUT, abbiamo deciso di ottimizzare i metodi di dissociazione tali che la sopravvivenza delle cellule si dissocia in finale sarebbe aumentato. Abbiamo determinato che la dissociazione dolce in Accumax (Cell Technologies innovative, Inc), manuale di filtraggio, e il flusso di smistamento a basse pressioni ci hanno permesso di ottenere la sopravvivenza sempre maggiore (&gt; 70% delle cellule totali) con rese successivi di progenitori neuronali sufficiente per l&#39;analisi a valle. Il metodo che descriviamo può essere generalmente applicato a isolare una varietà di popolazioni di neuroni da entrambi i tessuti fetali o adulto di topo.

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An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Una procedura ottimizzata per purificare neurali cresta progenitori neuronali derivate da tessuti fetali del mouse è descritto. Questo metodo sfrutta espressione da alleli reporter fluorescenti per isolare popolazioni discreti fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS). La tecnica può essere applicata per isolare sottopopolazioni neuronali durante lo sviluppo o da tessuti adulti.

Una procedura ottimizzata per fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) Isolamento del Sistema Nervoso Autonomo progenitori neurali da organi viscerali di topi fetali

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-formanti colonia saggio Cell: un test per discriminare Bona Fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Ricerca

Neuroscienze

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Generazione di cellule staminali neurali da scartate tessuto fetale umano corticale

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Un saggio di migrazione cellulare quantitativa per murini enterici neurali Progenitori

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Usando fluorescenza cellulare attivo Ordinamento per esaminare Cell-Type-specifica espressione genica nel cervello di ratto tessuto

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated di separazione delle cellule (FACS) e Gene Expression Analisi di Fos-esprimono neuroni da freschi e congelati Rat tessuto cerebrale

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Coltura cellulare primaria di neuroni GABAergici o glutamatergici purificati stabiliti attraverso la selezione di cellule attivate a fluorescenza

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...