Name: an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice
Uploaded: 2012-08-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

著者らは、イラストで芸術支援のためヴァンダービルト大学医療センターとメリッサA. Musserでフローサイトメトリーの共有リソースでサポートするために細胞解離の方法とケビン·ウェラー、デビッド·フラハティとブルターニュマトロックの提案のためにキャサリン·アルフォードに感謝します。我々は、博士に感謝します。神経前駆細胞の分離を実装する上でのアドバイスジャックモッシャーとショーンモリソン。 VMCフローサイトメトリーの共有リソースは、ヴァンダービルト·イングラムがんセンター（P30 CA68485）とヴァンダービルト消化器病研究センター（P30 DK058404）によってサポートされています。この作品は、健康補助DK064251、DK086594、とDK070219の米国国立研究所からの資金によって支えられている。

1。メディアの準備（組織培養フード内で行ったすべてのステップ） <ol><li>次の手順を組み合わせる：44 mlのL-15培地、0.5ミリリットル100Xペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）、0.5ミリリットルが100 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）、0.5ミリリットル1M HEPES、5 mlの組織培養グレードの水。追加する前に徹底的にBSAとP / Sを混在させるようにしてください。このボリュームは、最大の解離のた?...

<ol>
	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

蛍光レポーターを発現するマウスレポーター線は、マウス遺伝学コミュニティ1,8,9の複数の努力を通じて、広く利用可能になっています。結果として、ここで示した解離法が広く、胎児または成体組織のいずれかから神経伝達物質や受容体の発現パターンに基づいて、離散的なニューロンのサブタイプの分離に適用することができます。我々は、蛍光遺伝子レポーターの発現に基づい...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬名 </td><td> ベンダー </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>アキュマックス</td><td>シグマ（MFR：革新的なセルテクノロジーズ） </td><td> A7089-100ML </td><td> 1mlのアリコートで凍結保管してください</td></tr><tr><td> DNアーゼI </td><td>シグマ</td><td> D-4527 </td><td>保存されている-20℃で凍結1xHBSSのC 5 mg / mlと、 （1:5をクエンチ、クエンチで使用） </td></tr><tr><td> 10×PBSのpHを7.4 </td><td>ギブコ</td><td> 70011-044 </td><td>その後、滅菌フィルター組織培養グレードの水で1xにメイクアップ</td></tr><tr><td> 10X HBSS W / OのCaやMg </td><td>ギブコ</td><td> 14185-052 </td><td>その後、滅菌フィルター組織培養グレードの水で1xにメイクアップ</td></tr><tr><td>リーボビッツのL-15培地</td><td>ギブコ</td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン100X </td><td>ギブコ</td><td>15140-133 </td><td> -20℃でアリコートを格納</td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマ</td><td> A3912-100G </td><td> -20°C、水中では100 mg / mlになるように分注し、保管する</td></tr><tr><td> 0.85％NaClでのBiowhittaker 1MのHEPES </td><td>ロンザ</td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38μmのNITEXナイロンメッシュメンブレン</td><td> Sefarアメリカ</td><td> 3-38/22 </td><td> 〜3センチの正方形にカット。 UVは、組織培養フード内で殺菌するために一晩処理します。 </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td>インビトロジェン</td><td> A1310 </td><td> 1 mg / mlの</td></tr><tr><td> TRIZOL LS </td><td>インビトロジェン</td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 mlのポリスチレンチューブ</td><td>ファルコン</td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 mlコニカルチューブ</td><td>コー​​ニング</td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td>細かい解剖鉗子</td><td>ファイン科学·インスツルメンツ</td><td> 11251から30 </td><td>デュモン＃5 Forcep、Dumoxel、標準的なチップ0.1x0.06mm </td></tr><tr><td>解剖スプーン</td><td>ファイン科学·インスツルメンツ</td><td> 10370から18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

開発神​​経堤（NC）に由来神経前駆細胞は、腸と下部尿路のような内臓器官に自律神経節を形成する神経管から移行します。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションのようなメソッドを使用して、離散的集団のその分離は困難であるので、開発時には、成熟した組織の両方でこれらの細胞は、しばしば広く組織全体に分散されています。ただし、これらのチロシンヒドロキシラーゼ（TH）のようなニューロン特異的遺伝子の調節領域で駆動蛍光レポーターの発現によって直接可視化することができる。我々は可能なTHの高収率+腸解離と蛍光活性化セルソーティング（FACS）に基づいて、下の尿生殖路（LUT）を含む、胎児マウスの内臓組織から神経前駆細胞用に最適化する方法を説明します。 TH遺伝子は、カテコールアミンの生産のための律速酵素をコードしている。腸神経前駆細胞は、TH DURを表現し始める胎児の腸1とTHでの移行をることも大人の骨盤神経節ニューロンの2-4のサブセットに存在しています。この系統の最初の外観と、これらのLUTの他の側面のニューロン、およびその分離の分布が記載されていない。 THを発現する神経前駆細胞は、導入遺伝子コンストラクトのTg（TH-EGFP）DJ76Gsat/Mmnc 1を持つマウスにおけるEGFPの発現により容易に可視化することができる。我々は0.5 DPCとプラグ検出の朝を指定して、15.5日後に性交（DPC）で開発LUTにTHの分布+細胞を記録するために胎児のマウスでこの遺伝子の発現をイメージングし、観察された合体における神経前駆細胞のサブセット骨盤神経節急行EGFP。 LUT TH +神経前駆細胞を単離するために、我々は当初、胎児マウスの小腸2月6日から、神経堤幹細胞を精製するために使用された方法を最適化されています。依拠NC-から派生した集団を単離する前に努力フローサイトメトリー用細胞懸濁液を得るためのコラゲナーゼとトリプシンのカクテルで消化。私たちの手にこれらの方法は、比較的低い生存率LUTから細胞懸濁液を生成した。胎児のLUT組織における神経前駆細胞の既に低い発生率を考えると、我々は、最終的な解離の細胞生存率が増加されるような解離方法を最適化するために設定してください。我々は、私たちは下流の分析のために十分な神経前駆細胞のその後の収率で一貫してより大きな生存率（全細胞の&gt; 70％）を達成することができ、低圧力での並べ替え、その穏やかなACCUMAXで解離（革新的なセルテクノロジーズ株式会社）、マニュアルフィルタリング、およびフローを決定した。我々が記述する方法が広く、胎児または成体マウス組織のいずれかからニューロン集団の様々な分離に適用することができます。

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

胎児のマウス組織からの神経堤由来の神経前駆細胞を精製する最適化された手順が記載されています。このメソッドは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって離散的集団を分離するために蛍光レポーター遺伝子からの発現を利用しています。技術が開発を通して、大人の組織から神経細胞集団を単離するために適用することができます。

蛍光活性化細胞選別（FACS）胎児マウスの内臓からの自律神経前駆細胞の分離用に最適化された手順

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

神経コロニー形成細胞アッセイ：神経前駆細胞から善意の神経幹細胞を区別するアッセイ

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

廃棄されたヒト胎児脳組織から神経幹細胞の生成

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

マウス腸の神経前駆細胞の定量細胞遊走アッセイ

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

セル成体マウス脳室下帯から神経幹細胞および前駆細胞の選別とその細胞周期ダイナミクスのライブイメージング

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）と生鮮・冷凍ラット脳組織からのFos発現ニューロンの遺伝子発現解析

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

蛍光活性化細胞選別により確立された精製 GABAergic または Glutamatergic ニューロンの初代細胞培養

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...