Name: an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice
Uploaded: 2012-08-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

Författarna vill tacka Catherine Alford för förslag på cell dissociation metoder och Kevin Weller, David Flaherty och Bretagne Matlock för stöd i flödet Delade Cytometry Resource vid Vanderbilt University Medical Center och Melissa A. Musser för konstnärlig hjälp med illustrationer. Vi tackar Dr. Jack Mosher och Sean Morrison för råd om genomförandet av isolering av neuronala stamceller. VMC Flödescytometri delad resurs stöds av Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) och Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404). Detta arbete stöddes genom finansiering från US National Institutes of Health bidrag DK064251, DK086594 och DK070219.

1. Beredning av Media (Alla steg sker i vävnadskultur huv) <ol><li> Kombinera följande: 44 ml L-15 medium, 0,5 ml 100 X penicillin / streptomycin (P / S), 0,5 ml 100 mg / ml bovint serumalbumin (BSA), 0,5 ml 1 M HEPES, 5 ml vävnadsodlingskvalitet Vatten. Var noga med att blanda BSA och P / S ordentligt innan du lägger. Denna volym bör vara tillräckligt för dissociation av upp till fem olika vävnader typer. Detta medium kommer att användas i steg 3,4 för att framställa Kyla lösningar för användning efter ...

<ol>
	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

Mus reporter som uttrycker fluorescerande reportrar blir allmänt tillgänglig genom flera satsningar på murina genetik samhället 1,8,9. Som ett resultat av dissociation metod som illustreras här kan tillämpas allmänt för isolering av diskreta neuronala subtyper baserade på neurotransmittor-eller receptor-mönster expressionsvektorer från antingen fetala eller vuxna vävnader. Även om vi har optimerat denna metod, enligt uttryck för en fluorescerande transgen reporter, kan det också tillämpas på ...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens Namn </td><td> Leverantör </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Sigma (MFR: Innovativa Cell Technologies) </td><td> A7089-100ML </td><td> Lagra fryst i 1 ml alikvoter </td></tr><tr><td> DNas I </td><td> Sigma </td><td> D-4527 </td><td> Lagrades frysta vid -20 ° C 5 mg / ml i 1xHBSS, (Använt i släckningen, Quench 1:5) </td></tr><tr><td> 10 X PBS pH 7,4 </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> Späd till 1 x med vävnadsodlingskvalitet vatten och därefter sterilfilter </td></tr><tr><td> 10X HBSS v / o Ca eller Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> Späd till 1 x med vävnadsodlingskvalitet vatten och därefter sterilfilter </td></tr><tr><td> Leibovitzs L-15-medium </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin 100X </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> Lagra alikvoter vid -20 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-100G </td><td> Lagra alikvoter vid -20 ° C, 100 mg / ml i vatten </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M HEPES i 0,85% NaCl </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 m Nitex Nylon Mesh membran </td><td> Sefar America </td><td> 3-38/22 </td><td> Skär i ca 3 cm rutor. UV behandlar natten för att sterilisera i vävnadskultur huven. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml polystyrenrör </td><td> Falcon </td><td> 352.058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml koniska rör </td><td> Corning </td><td> 430.790 </td><td></td></tr><tr><td> Fina dissekera Tång </td><td> Fina Science Instrument </td><td> 11.251-30 </td><td> Dumont # 5 Forcep, Dumoxel, standard spets 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> Dissekera Spoon </td><td> Fina Science Instrument </td><td> 10.370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

Under utveckling neurallisten (NC)-härledda neuronala progenitorceller migrera bort från det neurala röret för att bilda autonom ganglier i inre organ såsom tarmen och nedre urinvägarna. Både under utveckling och mogna vävnader dessa celler är ofta spridda över hela vävnader så att isolering av diskreta populationer med hjälp av metoder som laser capture mikro-dissektion är svårt. De kan emellertid direkt visualiseras genom uttryck av fluorescerande reportrar drivna från regulatoriska regioner av neuron-specifika gener såsom tyrosinhydroxylas (TH). Vi beskriver ett förfarande optimeras för höga utbyten av livskraftiga TH + neuronala progenitorceller från fetala mus viscerala vävnaderna, inklusive tarmen och nedre urogenitalområdet (LUT), baserat på dissociation och fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS). TH-genen kodar det hastighetsbegränsande enzymet för produktion av katekolaminer. Enteriska neuronala stamceller att börja uttrycka TH durning sin vandring i fosterställning tarmen 1 och TH är också närvarande i en delmängd av vuxna bäcken ganglier neuroner 2-4. Det första uppträdandet av denna härstamning och fördelningen av dessa neuroner i andra aspekter av LUT och deras isolering har inte beskrivits. Neuronala stamceller uttrycker TH kan lätt visualiseras genom uttryck av EGFP i möss som bär på transgenen konstruktionen Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Vi avbildas uttryck för denna transgen i foster möss för att dokumentera fördelningen av TH + celler i utvecklingsländerna LUT vid 15,5 dagar efter coitus (DPC), betecknar morgonen plug-avkänning som 0,5 DPC, och konstaterade att en delmängd av neuronala stamceller i koalescerande bäcken ganglierna express EGFP. För att isolera LUT TH + neuronala stamceller, optimerad vi metoder som ursprungligen användes för att rena neurala celler crest stamceller från foster musen tarmen 2-6. Tidigare försök att isolera NC-härledda populationer som åberopasdigerering med en cocktail av kollagenas och trypsin för att erhålla cellsuspensioner för flödescytometri. I våra händer dessa metoder som produceras cellsuspensioner från LUT med relativt låg lönsamhet. Med tanke på den redan låga förekomsten av neuronala stamceller i fostrets LUT vävnader, satte vi ut för att optimera dissociation metoder så att cellöverlevnad i finalen dissocierar skulle ökas. Vi bestämde att milda dissociation i Accumax (Innovativa Cell Technologies, Inc), manuell filtrering, och flödet sortering vid låga tryck får oss att uppnå genomgående större överlevnad (&gt; 70% av totala celler) med efterföljande avkastningen för neuronala stamceller tillräckliga för nedströms analys. Metoden beskriver vi kan i stort sett användas för att isolera en mängd olika neuronala populationer från antingen foster eller en vuxen murina vävnader.

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

En optimerad förfarande för att rena neurallist-härledda neuronala stamceller från foster musvävnader beskrivs. Detta förfarande drar fördel av expression från fluorescerande reportergrupper alleler för att isolera diskreta populationer av fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS). Tekniken kan tillämpas för att isolera neuronala subpopulationer genom hela utvecklingen, eller från vävnader från vuxna.

Ett optimerat förfarande för fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) Isolering av autonom neural progenitorer från viscerala organ för Fetala Möss

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-kolonibildande Cell-analys: en analys att diskriminera Bona Fide neuronala stamceller från neurala stamceller

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Generering av neuronala stamceller från kasserade mänskliga foster Bark-Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

En kvantitativ cellmigrationsassay för Murina Enter Neural stamfäder

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, två kulturer: isolering och odling av vuxna neurala stamceller från de två neurogen zoner Individuell möss

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Använda Fluorescensaktiverad cellsortering för att Undersök Cell-Type-Specific Gene Expression i råtthjärnvävnad

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Cell Sortering av neurala stamceller och progenitorceller från vuxen mus subventrikulära zonen och Live-avbildning av sina cellcykeln Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och Gene Expression Analys av Fos-uttryckande nervceller från färsk och fryst Rat hjärnvävnad

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Isolering och odling av neurala föräldraparets följt av kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lysin 79 Dimethylation varumärke

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primär cell kultur av renade GABAergic eller Glutamatergic nerv celler etablerad genom Fluorescence-aktive rad cell sortering

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...