Name: labview-operated novel nanoliter osmometer for ice binding protein investigations
Uploaded: 2013-02-04T09:50:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations at JoVE.com

Bu araştırma ISF, NSF ve ERC tarafından desteklenmiştir. Biz Randy Milford, Michael Koren, Doug Shafer, ve Jeremy Dennison sıcaklık kademesi ile teknik yardım kabul etmek istiyorum. Yazılım geliştirme ile Yardımlaşma Veya Chen, Di Xu, Rajesh Sannareddy ve Sumit Bhattachary tarafından sağlanmıştır. Biz Mp IBP protein ve yararlı tartışmalar için ortak Prof Peter L. Davies ve Dr Laurie A. Graham teşekkür etmek istiyorum. Biz de teşekkür laboratuar üyeleri Dr Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, Dr Yeliz Çelik, Dr Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy ve kendi kullanıcı geri bildirimleri için Shlomit Guy.

0. Ön Prosedürler <ol><li> Cam çözüm enjeksiyon için kısımdır. Kılcal çektirmesi (Narishige, Tokyo, Japonya) kullanarak, bir cam kapiller mikro tüp (Marka GMBH, Wertheim, Almanya) ince bir açılış ile keskin bir pipet hazırlayın. Açıklık boyutu temiz su içinde ince köpürme sağlamak için kılcal içinden hava geçirerek doğrulanması gerekir. Kılcal kapalı ise, o zaman bir kenarından kırarak açabilirsiniz. Bu tüp duvarları içeren suya karşı bastırarak ya da hafifçe kazınarak gerçekleştirilebilir. Açılış neredeyse bloke edilir ama yeterince milimetrenin altındaki kabarcık oluşumuna izin açık olduğunu kapiller gibi hazırlayın. </li><li> Bakır disk temizleme. Çift distile su ile yıkayın, daha sonra% 0.1 Mikro-90 sabun (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, ABD) 10 dk bakır diskler sonikasyon. Bir izopropanol (teknik) çözeltisi içine diskler tanıtın ve 10 dakika için tekrar sonikasyon. Yüzgeçmüttefiki, filtrelenmiş hava kullanarak diskleri kurutun. Bu temizlik aşamasında deneyler arasındaki IBP kontaminasyonu önlemek için çok önemlidir. </li><li> Çift katmanlı coverglass montaj. A coverglass montaj kapağı cam yüzeyindeki nem yoğuşma olmadan örnek gözlem için izin vermek için hazırlanmıştır. Bu daha sonra bir sıcak tutkal tabancası ile yapıştırılmıştır iki lamelleri arasında Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, ABD) parçacık (çapı 2 mm) koyarak elde edildi. Bu konfigürasyon örnek düşük sıcaklıklara soğutulur ve gözlem penceresi üzerinde kuru hava üflemek için ihtiyaç kaldırıldı görünümünü blok olabilir yoğunlaşma engellemiştir. </li></ol> 1. Soğutma Sahne Kurulumu <ol><li> 4 mm iç çaplı Tygon tüp (Saint-Gobain, Paris, Fransa) ile soğutma aşamasında su akışı giriş ve çıkış bağlan, ve bir su pompası, su akışının giriş tüpü bağlanır. </li><li> Soğutma aşaması t girişine 4 mm&#39;lik bir iç çap Tygon tüp bağlankuru hava teslim o. Hava bir in-line Drierite kolon kullanılarak kurutulmuştur. </li><li> Hava ve su pompaları çalıştırın. Soğutma elemanları bir soğutucu olmadan çalıştırmak gerektiğini unutmayın. </li><li> Sıcaklık kontrol, kamera ve LabVIEW rutin açın. </li></ol> 2. Örnek Hazırlanması <ol><li> Disk ile delinen 500 mikron delikleri olan bir 7 mm çapında bakır diskin arka tarafında immersiyon yağı B (Cargille laboratuarlar, Cedar Grove, New Jersey, ABD) bir 3-4 ul damlacığı yerleştirin. </li><li> Aşağı bakacak immersiyon yağı tarafı ile soğutma sahnede bakır diski yerleştirin. </li><li> 2 ml&#39;lik bir cam şırıngaya (Poulten-Graf, Wertheim, Almanya) için diğer uçta bağlanmış bir 0.7 mm iç çaplı Tygon tüp ile bağlantı borusu (küt kenar) bağlanır. </li><li> Önceki kapiler tüp kullanarak, açılış (Ön prosedürler bakın) uygun bir büyüklükte olduğundan emin olmak için kılcal küçük deliğini kontrol edin. </li><li> Yavaşça gla takınss hazırlanan IBP protein örnek tüpü (pH 8 20 mM içinde 2.4 uM Mp IBP-GFP CaCl2 ve 25 mM Tris-HCl, hazırlama ayrıntılar için referans 10) içine kılcal ve kılcal cam 0.1 içerene kadar cam şırıngaya çekme Protein çözeltisi, ul. </li><li> LabVIEW yazılımı ile video kayıt başlayın. </li><li> Soğutma aşamasında bakır disk içinde deliklerin biri içine kılcal cam (protein çözeltisi içeren) keskin kenar yerleştirin. </li><li> (Olympus, Tokyo, Japonya, 10x objektif) mikroskop ile dikkat ederken, dikkatle cam kapiller ucu daldırma yağ tabakası nüfuz ve protein az miktarda (~ 10 nl) sunmak için cam şırınga (çok ince) tuşuna basın 200 mikron damlacık oluşturmak için bir çözüm. </li><li> Çift katmanlı coverglass montaj (Ön Prosedürler bakınız) ile soğutma aşamasında deliği kapatın. </li></ol> 3. TH Etkinlik Ölçümü <ol><li> Önss soğutma düğmesi ve -40 sıcaklığını ayarlamak ° C </li><li> Başlangıçta, çözüm damlacık açık olacaktır. Düşük sıcaklıklarda, tipik aralık içinde -30 ° C ile -35 çözelti dondurulmuştur belirten ° C, damlacık renk değiştirir. Toplu buz erimeye başlayana kadar örnek donduktan hemen sonra, yavaş yavaş sıcaklığını arttırın. Sıcaklığın bir kademeli artış numune tamamen erimesi neden olabilir sıcaklık aşılmaz önlemek için gereklidir. </li><li> Bir 50x objektif geçin ve sıcaklığını ayarlayarak buz erimeye başlar. Bu ayarlama, interaktif, ve son aşamalar, genellikle 0,002 ° C arasında küçük sıcaklık aşamalarını kullanarak gerçekleştirilir Tek bir kristal kalmayana kadar erimeye devam edin. Kristalin nihai boyutu 10 mikron civarında olmalıdır. Erime durdurulmuştur olan en yüksek ısı erime noktası olarak tespit edilir ve daha sonra video analiz aşamada doğru şekilde belirlenir. </li> &lt;li&gt; kristalin erime noktasının altındaki bir santigrat derece arasında birkaç yüzde için sıcaklığına getirin ve 10 dakika gecikme ile bir sıcaklık rampası başlar. Istediğiniz gibi rampalanma oranını ayarlayın. Bu süre zarfında, kristal IBPs maruz kalacağı. </li><li> 10 dakika maruz kalma süresi tamamlandıktan sonra, sıcaklık LabVIEW rutin otomatik olarak kontrol altında azalacaktır. </li><li> Sıcaklık azaldıkça olarak kristal şekli dikkate alınmalıdır. Bir noktada, buz kristali ani patlama görülebilir. Bu gerçekleştiği sıcaklık kristal patlama sıcaklığı olarak not edilir. </li><li> Doğru erime noktası ve patlama sıcaklığı belirlemek için video analiz kullanın. İlk olarak, görüntü analizleri kullanılarak, kesin erime noktası bulabilirsiniz. Erime bittikten hangi yüksek sıcaklık erime noktası olmaya kararlı olduğunu hatırlayın. Bir elektronik tablo programı bu erime noktası belgeleyin. Sonra, hassas kristal patlama sıcaklığı belirlemek ve bu değeri belgelemekgibi. Erime noktası ve donma noktası, veya kristal patlama sıcaklık arasındaki fark IBP çözeltisinin termal histerezis faaliyettir. </li></ol> 4. Zamana bağlı TH Aktivitenin Ölçümü <ol><li> Buzun tek bir kristali hazırlamak için Bölüm 3.1-3.3 de tarif edilen protokol takip edin. </li><li> Kristal oluşumunu sonra, istediğiniz gibi rampa gecikme süresini ayarlamak ve rampa açın. </li><li> Sıcaklığı otomatik kez rampa gecikme süresi dolduktan (operatörlerinin ihtiyaçlarına göre) sabit bir oranda azalacaktır. </li><li> Kristal çoğuşma oluştuğu sıcaklık belge. Pozlama süresi (kristal oluşumu ve kristal patlama arasındaki zaman) hesaplayın. </li><li> Çeşitli gecikme zamanları için deney tekrarlayın ve TH aktivitesi zaman bağımlılığı değerlendirmek için maruz kalma süresinin bir fonksiyonu olarak TH aktivitesi çizmek. </li></ol>

<ol>
	<li>DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteins+as+biological+antifreeze+agents+in+antarctic+fishes.">Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes.</a> Science. 172, 1152-1155 (1971).</li><li>Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carrot+leucine-rich-repeat+protein+that+inhibits+ice+recrystallization.">A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization.</a> Science. 282, 115-117 (1998).</li><li>Raymond, J. A., Knight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+binding,+recrystallization+inhibition,+and+cryoprotective+properties+of+ice-active+substances+associated+with+Antarctic+sea+ice+diatoms.">Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms.</a> Cryobiology. 46, 174-181 (2003).</li><li>Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+composition,+and+physical+properties+of+a+thermal+hysteresis+"antifreeze"+protein+from+larvae+of+the+beetle,+Tenebrio+molitor.">Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor.</a> Biochemistry. 21, 716-721 (1982).</li><li>Kiko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+freeze+protection+in+a+sea-ice+crustacean+through+horizontal+gene+transfer.">Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer.</a> Polar Biology. 33, 543-556 (2010).</li><li>Robinson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+adaptation+in+Arctic+and+Antarctic+fungi.">Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi.</a> New Phytol. 151, 341-353 (2001).</li><li>Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+antifreeze+protein+activity+in+Antarctic+lake+bacteria.">Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria.</a> Microbiology. 150, 171-180 (2004).</li><li>Raymond, J. A., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes.">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).</li><li>Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+evidence+for+quasi-permanent+attachment+of+antifreeze+proteins+to+ice+surfaces.">Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces.</a> Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).</li><li>Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superheating+of+ice+crystals+in+antifreeze+protein+solutions.">Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).</li><li>Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmolarity+of+tear+microvolumes+in+keratoconjunctivitis+sicca.">Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca.</a> Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).</li><li>Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive,+Ca2+-dependent+antifreeze+protein+in+an+Antarctic+bacterium.">A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium.</a> FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).</li><li>Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universality+of+persistence+exponents+in+two-dimensional+ostwald+ripening.">Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening.</a> Phys. Rev. Lett. 103, (2009).</li><li>Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+determining+ice+recrystallization+inhibition+by+antifreeze+proteins.">A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins.</a> Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).</li><li>Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solute+Effects+on+Ice+Recrystallization+-+an+Assessment+Technique.">Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique.</a> Cryobiology. 25, 55-60 (1988).</li><li>Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth.">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).</li><li>Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+protein+from+freeze-tolerant+grass+has+a+beta-roll+fold+with+an+irregularly+structured+ice-binding+site.">Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site.</a> J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu çalışma olağanüstü ısı kontrolü ile TH aktivitesinin doğru ölçümleri mümkün kılar bir bilgisayar kontrollü nanolitre Ozmometre çalışmasını gösterir. Herhangi bir sıcaklık duyarlı sisteminde, istenmeyen sıcaklık değişimleri kaçınılmalıdır. Burada sunulan cihaz içinde sıcaklık gradyanları önlemek için, test çözeltisi damla bakır disk soğuma evresi (adım 2.7) içinde bir deliğin merkezi olarak konumlandırılmış olmalıdır. Ayrıca, tek bir kristal damlacık merkezinde ziyade kenarlarına yakın olmalıdır (çoğu durumda, bu kendiliğinden gerçekleşir). Açıklandığı zaman bağımlılığı soğutma hızı TH okumalarını etkiler olabileceğini gösterir. Böylece, kristal soğutma önce çözelti maruz kaldığı süreyi bir rapor, hem de soğutma hızı dahil olmak üzere göstermektedir. Biz genellikle 0.01 sıcaklık aşağı Ramping önce 10 dakika bekledi ° C her 4 sn adımlar. LabVIEW kontrollü işbirliğioling aşama microfluidic cihazlar termal olarak manipüle edilebilir, üzerinde bir ters mikroskop ile kullanım için adapte edilmiştir. Bu sistem eGFP, 9, 10, 16 ile etiketlendi buz kristalleri ve IBPs içeren çözelti değiş tokuş deneylerin yapılması kolaylaştırır. LabVIEW kontrollü sistem belirli bir uyum elektrik devresi yoluyla 3.040 sıcaklık kontrol bağlayarak bir Clifton aşama için adapte edilebilir. Böyle bir sistem, Davies laboratuvar 17 işletilmektedir. LabVIEW yazılım ve Clifton aşaması için belirlenen adapte elektrik devresi tasarımı istek üzerine mevcuttur. Sonuç olarak, hassas kontrol ve manipülasyon sıcaklık ve gerçek zamanlı analiz için LabVIEW rutin yoluyla bir video arayüzü ile koordineli sıcaklık artış ve azalış oranı (0.002 ° C hassasiyet ile), kolaylaştıran bir nanolitre Osmometer açıklar. Bu sistem importan vardır tekrarlanabilir hızı kontrollü deneyler gerçekleştirebilirsinizbuz ile IBP etkileşimlerinin kinetik araştırmak için t. Bu tür deneyler IBPs etki mekanizması çevreleyen birkaç uzun zamandır tartışılan sorunları ele alabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası / model </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Daldırma yağı Tip B </td><td> Cargille Laboratuvarlar </td><td> 16484 </td><td></td></tr><tr><td> Drierite </td><td> WA Hammond Drierite </td><td> 043.063 2270g </td><td></td></tr><tr><td> Mikro 90 temizleme solüsyonu </td><td> Cole-Parmer </td><td> <a href="http://www.coleparmer.com/Product/Cole_Parmer_small_sup_reg_sup_small_Micro_90_small_sup_reg_sup_small_cleaning_solution_case_of_four_4_Liter_bottles/EW-18100-11" target="_blank">EW-18100-11</a> </td><td></td></tr><tr><td> Çektirme Kapiller </td><td> Narishige </td><td> PB-7 </td><td></td></tr><tr><td> Cam kılcal tüpler </td><td> Marka GNBH </td><td> 7493 21 </td><td> Uzun 75 mm, 1.15 çapında </td></tr><tr><td> Sıcaklıkkontrolör </td><td> Newport, Irvine, California, Amerika Birleşik Devletleri </td><td> Model 3040 </td><td> Model 3040 </td></tr><tr><td> Işık mikroskobu </td><td> Olimpos </td><td> Model BH2 </td><td></td></tr><tr><td> 10x objektif </td><td> Olimpos </td><td></td><td> S Planı 10, 0.3, 160/0.17 </td></tr><tr><td> 50x objektif </td><td> Nikon </td><td></td><td> CF planı, 50X/0.55 EPI ELWD </td></tr><tr><td> CCD Kamera </td><td> Provideo </td><td> CVC-140 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon tüpü </td><td> Saint-Gobain, Paris, Fransa </td><td></td><td> Tygon Formülasyon S-50-HL Boru </td></tr><tr><td> Cam şırınga (2 mi) </td><td> Poulten-Graf, Wertheim, Almanya </td><td> 7 10227 </td><td></td></tr><tr><td> GPIB-PCI kart </td><td> Ulusal aletleri, Austin, Texas, ABD </td><td> 778032-01 </td><td></td></tr><tr><td> Video frame gragrafik çubuklarıyla bBER IMAQ-PCI-1407 </td><td> Ulusal aletleri, Austin, Texas, ABD </td><td> 322156B-01 </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW Sistem Tasarım Yazılımı </td><td> Ulusal aletleri, Austin, Texas, ABD </td><td> Sürüm 8 </td><td></td></tr><tr><td> DivX Author programı </td><td> Divx LLC, San Diego, CA, USA </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

labview-operated novel nanoliter osmometer for ice binding protein investigations

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 &deg;C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 &mu;m in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

TH zaman bağımlılık ölçümü LabVIEW çalışan nanolitre Osmometer doğru TH aktivitesi ölçümleri performansı kolaylaştırır. Sabit sıcaklık azalma oranı TH zaman bağımlılık ölçümü izin. Nanolitre Osmometer tarafından etkinleştirilmiş hassas sıcaklık kontrolü bu deneyler için çok önemliydi. Çözelti içinde IBPs, bir buz kristalinin maruz kalma süresi kristali (kristal burst) etrafında buz ani büyüme kadar kristal oluşumu gelen zaman aralığı (erime işleminin sonunda) olarak tanımlanır. Biz IBPs için buz kristallerinin pozlama süresi önemlisi TH aktivitesini etkilediği belirlenmiştir. IBP pozlama (birkaç saniye) kısa dönemler Mp IBP-GFP çözeltisi (2.4 uM) (Şekil 5), düşük TH aktivitesi üretti. Bu 4 dk IBP pozlama bir platoya ulaştı kadar TH aktivitesi IBP pozlama süresi artmıştır. Yüksek IBP konsantrasyonlarda, plakaau kısa zamanlarda ulaşılmıştır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig1.jpg" /> Şekil 1. Şematik gösteren IBPs buz adsorbe. 10 izni ile benimsendi. <img alt="Şekil 2," fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig2.jpg" /> Şekil 2. Soğuma evresi. A) mikroskop tüpler bağlandı. B) Üst kurşun olmadan. C) şematik diyagramı. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4189/4189fig2large.jpg" target="_blank"> </a><img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig3.jpg" /> Şekil 3. LabVIEW arayüzü ekran görüntüsü. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4189/4189fig3large.jpg" target="_blank">Cl</a>büyük bir rakam görmek için buraya Ick. <img alt="Şekil 4," fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig4.jpg" /> Şekil 4. Sıcaklık stabilitesi grafiği. Sıcaklık kontrol sıcaklığı 0.01 ° C, 15 sn düşürmek için kurulmuştur. <img alt="Şekil 5," fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig5.jpg" /> Şekil 5. IBPs buz kristali kalma süresinin bir fonksiyonu olarak Mp IBP TH aktivitesi. Her zaman noktasında 3-6 deneylerin ortalamasıdır.

Watch this Scientific Journal Video about LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations at JoVE.com

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Ayrıca antifriz proteinleri olarak bilinen buz bağlayıcı protein (IBPs), buz büyümesini engelleyen ve doku dondurma kullanım için umut verici bir katkı maddesi vardır. IBPs araştırmak için kullanılan başlıca araç nanolitre Osmometer olduğunu. Biz bir optik mikroskop üzerine monte edilmiş bir ev tasarlanmış soğutma aşamasında geliştirilen ve özel olarak geliştirilmiş bir LabVIEW rutin kullanılarak kontrol. Nanolitre Osmometer ultra-hassas bir şekilde numune sıcaklık manipüle burada açıklanan.

Buz Bağlayıcı Protein İncelemelerde LabVIEW çalıştırılan Roman nanolitre Ozmometre

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

Tek molekül Protein Araştırmaları Yüzey Pasifleme

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Kovalent Öz-monte tabakalı Yaklaşım Kullanarak Yüzeyler üzerinde BMP-2 bağlanması

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Malarya Protein Biyomarker Histidin Zengin Protein-II Tespiti için İridyum (III) Lüminesans Probe

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

Bir ELISA Tabanlı Bağlama ve Rekabet Yöntemi Hızla Ligand-reseptör Etkileşimleri belirleme

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

CN-GELFrEE - net yerli jel-elüt sıvı kısmı Tuzak Elektroforez

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

EOB-DTPA ve Ga (III) Complex Araştırmalar Onun<sup&gt; 68</sup&gt; Ga Radyoaktif Analog

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

Yapısal Photoresponsive sıvı kristaller dinamikleri gözlemlemek için yeni teknikleri

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...