Name: flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Wij danken dr. R. Michael Sramkoski voor hulp bij flowcytometrie, Dr Purnima Jaiswal en Dr Di Wu voor eerdere input en Ilya Aylyarov voor hulp bij de illustraties. Ondersteund door NIH Grant R01GM089872 en de Cytometry &amp; Imaging Microscopy Core Facility van de zaak Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).

1. Haploïde Cell Growth <ol><li> Grow S. cerevisiae cellen van de S288C achtergrond (BY4741) onder standaard condities 10. </li><li> Transformeer haploiden om ofwel drukken van de twee opvallende fluorescerende markers 10. De markers keuze oplosbaar GFP expressie in het cytoplasma (pEG220, URA3/YIp, gelineariseerd met BglII 11) en een ribosomaal eiwit, RPL25, gefuseerd met mCherry (pAJ1661, URA3/CEN van A. Johnston). We verwachten dat gelijke tweekleurige zuivering protocolle...

<ol>
	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

De beschikbaarheid van gezuiverde zygoten moet biochemische studies waaronder transcriptomics, proteomics en lipidomics, alsmede onderzoek mechanismen waardoor zygoten ondergaan celcyclus opnieuw binnenkomen, celwand remodelleren budding en overerving kenmerken, enz. Alternatief vergemakkelijken, kunnen worden gegenereerd vanaf zygoten met stammen die karakteristieke mutaties in een of beide ouders. Bovendien, de gezuiverde zygoten, zoals op haploïde of diploïde cellen worden ingevroren in medium met 15% glycerol en l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens / Equipment </td><td> Bron </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, codeert cytoplasmatische GFP 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, codering RPL25 gefuseerd met mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonicator </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Polypropyleen buis met schroefdop </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Gekoelde microcentrifuge </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Flowcytometrie schede oplossing </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> iCyt Reflectie Model Flow Cytometer </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision deconvolutie microscoop </td><td> Toegepaste Precision </td><td></td></tr><tr><td> Upright epifluorescentiemicroscoop </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15.510-07 </td></tr><tr><td> CSM glucose formulering Opmerkingen: Voor agarplaten gewoon omvatten 2% agar (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Zygoten zijn essentiële tussenproducten tussen haploïde en diploïde staten in de levenscyclus van veel organismen, met inbegrip van gist (figuur 1) 1. S. cerevisiae zygoten resultaat van de fusie van haploïde cellen van verschillende mating type (MATa, MATalpha) en leiden tot overeenkomstige stabiele diploïde die achtereenvolgens genereren liefst 20 diploïde nakomelingen als gevolg van hun opvallend asymmetrische mitotische delingen 2. Zygote vorming georkestreerd door een complexe reeks gebeurtenissen: Hierbij oplosbare mating factoren binden aan receptoren verwant, triggering receptor-gemedieerde signaaltransductie cascades die onderbreking van de celcyclus en uitmonden vergemakkelijken cel-cel fusie. Zygoten kan worden beschouwd als een model van voorlopercellen of stamcellen functie. Hoewel er veel is geleerd over de vorming van zygoten en hoewel zygoten zijn gebruikt om cel-moleculaire aangelegenheden van algemeen signi onderzoekenicance, bijna alle studies hebben gebruik gemaakt van de paring mengsels waarin zygoten worden vermengd met een meerderheid van de bevolking van de haploïde cellen 3-8. Veel aspecten van de biochemie van zygote vorming en de voortgaande leven van de zygote blijven dan ook niet onderzocht. Rapporten van zuivering van gist zygoten beschreven protocollen gebaseerd op hun sedimentatie eigenschappen 9, maar dit sedimentatie gebaseerde procedure leverde geen bijna 90% zuiverheid in handen. Bovendien heeft het nadeel dat cellen blootgesteld aan hypertone sorbitol. Wij hebben een veelzijdig zuiveringsprocedure. Daartoe paren haploïde cellen die rood of groen fluorescerende eiwitten werden geco-incubeerd met zygote vorming geoogst op verschillende tijdstippen, en de resulterende zygoten werden gezuiverd met een flow cytometrie gebaseerd sorteren protocol. Deze techniek biedt een handige visuele beoordeling van zuiverheid en rijping. De gemiddelde zuiverheidvan de fractie ongeveer 90%. Volgens de timing van de oogst, kan zygoten van verschillende graden van rijpheid worden hersteld. De gezuiverde monsters zorgen voor een geschikt punt van vertrek voor &quot;-sche&quot; studies, voor het herstel van de initiële nakomelingen, en voor systematisch onderzoek van deze stamceltransplantatie.

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Om zygoten van zuiveren<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Werden haploïde cellen van tegengestelde mating type gemanipuleerd om rood of groen fluorescerende eiwitten, co-geïncubeerd tot zygote vorming mogelijk te maken en gefractioneerd met een flowcytometrie-based protocol drukken. De zeer verrijkte fractie maakt daaropvolgende &quot;-sche&quot; studies, het herstel van de initiële nakomelingen, en systematisch onderzoek van de zygote morfogenese.

Flowcytometrie gebaseerde Zuivering van<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygoten

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Test voor Adhesie en Agar invasie in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expressie en zuivering van de Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator Eiwit in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

High Throughput micro-injecties van Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Zuivering van het Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator eiwit dat tot expressie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...