Name: flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00
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Nous remercions le Dr R. Michael Sramkoski de l&#39;aide pour la cytométrie en flux, le Dr Purnima Jaiswal et le Dr Di Wu pour entrée tôt et Ilya Aylyarov de l&#39;aide pour les illustrations. Soutenu par des subventions du NIH R01GM089872 et la cytométrie &amp; Imaging Microscopy Facility base du Centre de cas Comprehensive Cancer (P30 CA43703).

1. La croissance des cellules haploïdes <ol><li> Cultivez S. cerevisiae S288C de l&#39;arrière-plan (BY4741) dans des conditions normales 10. </li><li> Transformez haploïdes pour exprimer l&#39;un des deux marqueurs fluorescents visibles 10. Les marqueurs de choix sont la GFP soluble exprimée dans le cytoplasme (pEG220, URA3/YIp, linéarisé avec BglII 11) et une seule protéine ribosomique, RPL25, fusionné avec mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, de A. Johnston). Nous nous atten...

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	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

La disponibilité des zygotes purifiés devrait faciliter les études biochimiques, y compris la transcriptomique, la protéomique et la lipidomique, ainsi que des enquêtes sur les mécanismes par lesquels les zygotes subissent cycle cellulaire rentrée, remodelage de la paroi cellulaire, caractéristiques en herbe et à l&#39;héritage, etc Alternativement, les zygotes pourraient être générés à partir avec des souches porteuses de mutations caractéristiques dans l&#39;un ou les deux parents. En outre, les zygote...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif / équipement </td><td> Source </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, codant pour la GFP cytoplasmique 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, l&#39;encodage RPL25 fusionnée à mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonicateur </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Tube en polypropylène avec couvercle passoire </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Microcentrifugeuse réfrigérée </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Solution gaine cytométrie en flux </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> Réflexion ICYT Modèle cytomètre de flux </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> Microscope déconvolution DeltaVision </td><td> Applied Precision </td><td></td></tr><tr><td> Microscope droit à épifluorescence </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> Formulation de glucose CSM Notes: Pour les plaques d&#39;agar agar, il suffit d&#39;inclure 2% (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Zygotes sont des intermédiaires essentiels entre les haploïdes et diploïdes états du cycle de vie de nombreux organismes, y compris la levure (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes résultat de la fusion de cellules haploïdes de type sexuel distinct (MATa, MATalpha) et donner lieu à des correspondants diploïdes stables qui génèrent successivement jusqu&#39;à 20 descendance diploïde en raison de leurs divisions mitotiques étonnamment asymétriques 2. Formation Zygote est orchestré par une séquence complexe d&#39;événements: Dans ce processus, les facteurs d&#39;accouplement solubles se lient aux récepteurs apparenté, déclenchant médiés par le récepteur cascades de signalisation qui facilitent l&#39;interruption du cycle cellulaire et aboutir à fusion cellule-cellule. Zygotes peut être considéré comme un modèle pour les progéniteurs ou de la fonction des cellules souches. Même si on a beaucoup appris à propos de la formation des zygotes et bien zygotes ont été utilisés pour étudier les cellules moléculaires des questions d&#39;intérêt général Significance, presque toutes les études ont eu recours à des mélanges d&#39;accouplement dans laquelle sont mélangés des zygotes avec une majorité de la population de cellules haploïdes 3-8. De nombreux aspects de la biochimie de la formation du zygote et la vie continue du zygote restent donc d&#39;une enquête. Rapports de purification des zygotes levure décrire les protocoles basés sur leurs propriétés de sédimentation 9; toutefois, cette procédure basée sur la sédimentation n&#39;a pas donné près de 90% de pureté dans nos mains. En outre, elle présente l&#39;inconvénient que les cellules sont exposées au sorbitol hypertonique. Nous avons donc mis au point un procédé de purification polyvalente. A cet effet, des paires de cellules haploïdes exprimant rouges ou verts protéines fluorescentes ont été co-incubées pour permettre la formation du zygote, récoltées à des moments différents, et les zygotes obtenus ont été purifiés en utilisant un protocole de triage par cytométrie de flux à base de. Cette technique permet une évaluation visuelle pratique de la pureté et de la maturation. La pureté moyennede la fraction est d&#39;environ 90%. Selon le moment de la récolte, les zygotes de différents degrés de maturité peut être récupéré. Les échantillons purifiés fournir un point de départ commode pour les «-omiques» des études, pour la récupération de la descendance initiale, et une enquête systématique de cette cellule souche.

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Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Pour purifier les zygotes de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;, Les cellules haploïdes de type sexuel opposé ont été modifiées pour exprimer rouges ou verts protéines fluorescentes, co-incubées pour permettre la formation du zygote, et fractionnés en utilisant une cytométrie de flux à base de protocole. La fraction hautement enrichi permet ultérieur &quot;-omiques», les études, la reprise de la descendance initiale, et l&#39;investigation systématique de la morphogenèse zygote.

Cytométrie en flux à base de purification de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

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