Name: flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

אנו מודים לד&quot;ר ר &#39;מיכאל Sramkoski לעזרה עם cytometry זרימה, ד&quot;ר Purnima Jaiswal וד&quot;ר די וו עבור קלט מוקדם יותר ואיליה Aylyarov לעזרה באיורים. נתמך על ידי NIH גרנט R01GM089872 וCytometry &amp; Core מתקן הדמיה מיקרוסקופית של קייס מרכז הסרטן המקיף (P30 CA43703).

1. צמיחת תאי הפלואידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ס תאי cerevisiae מרקע S288C (BY4741) בתנאים רגילים 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך haploids להביע אחד משני סמנים בולטים ניאון 10. הסמנים של בחירה הם GFP מסיס הביע בציטופלסמה (pEG220, URA3/Y...

<ol>
	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

הזמינות של זיגוטות מטוהרות צריכה להקל על מחקרים ביוכימיים כולל transcriptomics, פרוטאומיקה וlipidomics, כמו גם חקירה של מנגנונים שבאמצעותם זיגוטות עוברות מחזור תא כניסה מחדש, שיפוץ דופן תא, מאפייני ניצנים וירושה, וכו &#39;לחלופין, זיגוטות יכולות להיות שנוצרו החל עם זנים שנשאו מוטצ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב / ציוד </td><td> מקור </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, GFP קידוד cytoplasmic 11) </td><td> א Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, הקידוד RPL25 התמזג mCherry </td><td> א ג&#39;ונסטון </td><td></td></tr><tr><td> sonicator הפישר FB120 </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td></td></tr><tr><td> צינור פוליפרופילן עם מסננת כובע </td><td> BD פלקון </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> microfuge קירור </td><td> טומי </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> פתרון נדן הזרימה cytometry </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> Cytometer זרימת דגם ההשתקפות iCyt </td><td> סוני </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ deconvolution DeltaVision </td><td> אפלייד Precision </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ epifluorescence הזקוף </td><td> ליקה </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> ניסוח גלוקוז CSM הערות: לצלחות אגרו, פשוט כוללות אגרה 2% (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

זיגוטות הן ביניים מהותיים בין הפלואידים ומדינות דיפלואידיים במחזור החיים של אורגניזמים רבים, כולל שמרים (איור 1) 1. S. cerevisiae זיגוטות תוצאה מהאיחוי של תאים מסוג ההפלואידים הזדווגות מובחן (מאטה, MATalpha) ולהצמיח diploids היציב המקביל שיוצרים ברציפות רבה כמו 20 צאצאי דיפלואידי כתוצאה מחטיבות mitotic להדהים הסימטריות 2. היווצרות הזיגוטה היא בניצוחו של רצף מורכב של אירועים: בתהליך זה, גורמי הזדווגות מסיסות נקשרים לקולטנים מאותו המקור, מפעילים מפלי איתות קולטן בתיווך המאפשרים הפסקה של מחזור התא ומגיע לשיא באיחוי תאי תאים. זיגוטות עשויות לשמש מודל למולידו או תפקוד של תאי גזע. למרות שדברים רבים כבר למד על היווצרות זיגוטות ולמרות זיגוטות שמשו כדי לחקור שאלות תא מולקולרית של כללי significance, כמעט כל המחקרים נעשה שימוש בתערובות הזדווגות שבזיגוטות מעורבבות עם רוב אוכלוסייה של תאי ההפלואידים 3-8. היבטים רבים של הביוכימיה של היווצרות הזיגוטה והחיים המתמשכים של הזיגוטה לכן יישארו לא נחקרו. דיווחים על טיהור זיגוטות שמרים לתאר פרוטוקולים המבוססים על תכונות שיקוע 9, אולם, הליך המבוסס על שקיעה זו לא הניב כמעט 90% טוהר בידות שלנו. יתר על כן, יש לו את החסרון שתאים נחשפים לסורביטול hypertonic. לכן פתחנו הליך טיהור תכליתית. לצורך כך, זוגות של תאי ההפלואידים מבטאים חלבוני ניאון אדומים או ירוקים היו שותף מודגרות-לאפשר היווצרות הזיגוטה, שנקטף בזמנים שונים, וכתוצאה מכך זיגוטות טוהרו באמצעות פרוטוקול מיון cytometry מבוסס זרימה. טכניקה זו מספקת הערכה חזותית נוחה של טוהר והתבגרות. הטוהר הממוצעשל השבר כ 90%. על פי העיתוי של קציר, זיגוטות בדרגות שונות של בשלות ניתן לשחזר. את הדגימות המטוהרות מספקות נקודה נוחה של יציאה ללימודים &quot;omic&quot;, להתאוששות של צאצאים ראשוניים, ולחקירה שיטתית של תאי אב זה.

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

כדי לטהר זיגוטות של<em&gt; ס cerevisiae</em&gt;, תאי ההפלואידים מסוג ההזדווגות נגדי הונדסו חלבונים אדומים או ירוקים ניאון, שיתוף מודגרות-לאפשר היווצרות הזיגוטה, ומופרד באמצעות פרוטוקול זרימת cytometry מבוסס. החלק מאוד המועשר מאפשר לימודים, התאוששות שלאחר מכן &quot;omic-&quot; של צאצאים ראשוניים, ובדיקה שיטתית של המורפוגנזה הזיגוטה.

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...