Name: flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Vi takker Dr. R. Michael Sramkoski for hjelp med flowcytometri, Dr. Purnima Jaiswal og Dr. Di Wu for tidligere innspill og Ilya Aylyarov for hjelp med illustrasjonene. Støttet av NIH Grant R01GM089872 og cytometri &amp; Imaging Mikroskopi Kjerne Facility av Case Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).

1. Haploid Cell Vekst <ol><li> Grow S. cerevisiae celler fra S288C bakgrunn (BY4741) under standard betingelser 10. </li><li> Transformere haploids å uttrykke en av to iøynefallende fluorescerende markører 10. Markørene av valget er løselig GFP uttrykt i cytoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearisert med Bglll 11) og en enkel ribosomal protein, RPL25, smeltet sammen med mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, fra A. Johnston). Vi forventer at tilsvarende to farger rensing protokoller kan ...

<ol>
	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

Tilgjengeligheten av rensede zygoter bør legge til rette biokjemiske studier inkludert transcriptomics, proteomikk og lipidomics, samt etterforskning av mekanismer som zygoter gjennomgår cellesyklus re-entry, celleveggen remodeling, spirende og arv egenskaper, etc. Alternativt kan zygoter bli generert starter med stammer bærer karakteristiske mutasjoner i en eller begge foreldre. Videre, de rensede zygoter, som for haploide eller diploide celler, kan fryses i medium inneholdende 15% glycerol og senere opptint å over...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens / utstyr </td><td> Kilde </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, koding cytoplasmisk GFP 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, koding RPL25 smeltet til mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonikator </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Polypropylenrør med sil cap </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Nedkjølt mikrosentrifuge </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Flowcytometri kappe løsning </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> iCyt Reflection Modell flowcytometeret </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision dekonvolusjon mikroskop </td><td> Applied Precision </td><td></td></tr><tr><td> Oppreist epifluorescence mikroskop </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> CSM glukose formulering Merknader: For agarplater, bare inkluderer 2% (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Zygoter er viktige mellomprodukter mellom haploid og diploid stater i livssyklusen til mange organismer, inkludert gjær (figur 1) 1. S. cerevisiae zygoter resultat fra fusjon av haploide celler av distinkte parring type (Mata, MATalpha) og gi opphav til tilsvarende stabile diploider som suksessivt genererer så mange som 20 diploid avkom som et resultat av deres påfallende asymmetriske mitotiske divisjoner 2. Zygote formasjonen er orkestrert av en kompleks sekvens av hendelser: I denne prosessen, oppløselige parring faktorer bindes til beslektet reseptorer, utløser reseptormediert signalmolekyler kaskader som letter avbrudd av cellesyklusen og kulminerer i celle-celle-fusjon. Zygoter kan betraktes som en modell for stamfar eller stamcelletransplantasjon funksjon. Selv om mye har blitt lært om dannelsen av zygoter og selv zygoter har blitt brukt til å undersøke celle-molekylære spørsmål av generell betydicance, nesten alle studier har benyttet seg av parring blandinger der zygoter er blandede med en majoritetsbefolkningen av haploide cellene 3-8. Mange aspekter av biokjemi zygote formasjon og den fortsatte livet av zygote derfor forbli undersøkte. Rapporter om rensing av gjær zygoter beskriver protokoller basert på deres sedimentering egenskaper 9., men gjorde dette sedimentering-baserte prosedyren ikke gi nesten 90% renhet i våre hender. Videre har den den ulempe at cellene er utsatt for hyperton sorbitol. Vi har derfor utviklet en allsidig rensing prosedyre. For dette formålet ble par haploide celler som uttrykker røde eller grønne fluorescerende proteiner inkubert for å tillate zygoten formasjon, høstes på ulike tidspunkter, og de resulterende zygoter ble renset ved hjelp av en flowcytometri-basert sortering protokollen. Denne teknikken gir en praktisk visuell vurdering av renhet og modning. Gjennomsnittlig renhetav fraksjonen er ca 90%. Ifølge tidspunktet for høsting, kan zygoter av varierende grad av modenhet gjenopprettes. Renset prøvene gir en praktisk utgangspunkt for &quot;-omic&quot; studier, for gjenvinning av første avkom, og for systematisk undersøkelse av denne stamceller.

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Å rense zygoter av<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Ble haploide celler av motsatt parring attraksjon konstruert for å uttrykke røde eller grønne fluorescerende proteiner, co-inkuberte å tillate zygoten dannelse, og fraksjonert ved hjelp av en flowcytometri-basert protokoll. Den svært beriket brøkdel gjør påfølgende &quot;-omic&quot; studier, utvinning av første avkom, og systematisk undersøkelse av zygote morphogenesis.

Flowcytometri-basert Rensing av<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygoter

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Uttrykk og rensing av Cystisk fibrose transmembrane Conduktans Regulator Protein i Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimalisert flekker og spredning modellering Metoder for Celledeling Overvåking hjelp Cell Tracking Fargestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Høy gjennomstrømning Microinjections av Sea Urchin zygoter

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...