Name: flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Мы благодарим д-р Р. Майкл Sramkoski за помощью проточной цитометрии, д-р Пурнима Jaiswal и д-р Di Wu для более ранних вход и Илья Aylyarov за помощь с иллюстрациями. Поддерживается NIH Грант R01GM089872 и цитометрии и изображений микроскопии Основной фонд на случай Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).

1. Гаплоидное роста клеток <ol><li> Расти С. CEREVISIAE клеток из S288C фона (BY4741) в стандартных условиях 10. </li><li> Преобразование гаплоидов, чтобы выразить любую из двух заметных флуоресцентные маркеры 10. Маркеры выбора являются растворимыми GFP выражается в цитоплазме (pEG220, URA3/YIp, ли?...

<ol>
	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

Наличие очищают зиготы должно способствовать биохимических исследований, включая транскриптомику, протеомики и lipidomics, а также исследование механизмов, с помощью которых зиготы проходят клеточный цикл повторного входа, реконструкции клеточной стенки, начинающие и наследования харак...

<table border="1"><tbody><tr><td> Реагент / Оборудование </td><td> Источник </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, кодирующий GFP цитоплазматические 11) </td><td> Э. Гроте </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, кодирование RPL25 слит с mCherry </td><td> А. Джонстон </td><td></td></tr><tr><td> Фишер FB120 ультразвукового </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Полипропиленовые трубы с фильтром крышкой </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Холодильные микроцентрифуге </td><td> Томия </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Проточной цитометрии оболочки решения </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> iCyt Отражение модели потока Цитометр </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision деконволюции микроскопом </td><td> Прикладная Precision </td><td></td></tr><tr><td> Вертикальный эпифлуоресцентной микроскопом </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Агароза </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> Разработка CSM глюкозы Примечание: Для агара, просто есть 2% агара (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Зиготы необходимы промежуточные между гаплоидных и диплоидных государства в жизненном цикле многих организмов, включая дрожжи (рис. 1) 1. С. CEREVISIAE зигот в результате слияния гаплоидных клеток различных типов спаривания (Мата, MATalpha) и вызывает соответствующие стабильным диплоиды, последовательно генерировать целых 20 диплоидного потомства в результате их поразительно асимметричная митотических делений 2. Зигота формирование организованных сложную последовательность событий: в этом процессе, растворимых факторов спаривания связывают родственные рецепторы, вызывая рецептор-опосредованных сигнальных каскадов, которые способствуют прекращение клеточного цикла и завершится в межклеточных синтеза. Зиготы может рассматриваться как модель для предшественников или функцию стволовых клеток. Хотя многое узнали о формировании зиготы и, хотя зиготы были использованы для исследования клеточного молекулярного вопросы общей значиicance, почти все исследования использовались спаривания смесей, в которых зиготы перемешаны с большинством населения гаплоидных клеток 3-8. Многие аспекты биохимии образование зиготы и продолжения жизни зиготы, следовательно, остаются неизученными. Доклады очистки дрожжей зиготы описывают протоколы, основанные на их осаждения свойства 9, однако это осаждения на основе процедуры не дали почти 90% чистоты в наших руках. Кроме того, он имеет тот недостаток, что клетки подвергаются воздействию гипертонический сорбит. Поэтому мы разработали универсальную процедуру очистки. Для этой цели пар гаплоидных клеток, экспрессирующих красного или зеленого флуоресцентного белка был инкубируют, чтобы образование зиготы, собранных в разное время, и в результате зиготы очищали с использованием проточной цитометрии сортировка на основе протокола. Эта технология обеспечивает удобную визуальную оценку чистоты и созревания. Средняя чистотафракции составляет около 90%. По времени сбора урожая, зигот различной степени зрелости могут быть восстановлены. Очищенные образцы обеспечивают удобную отправную точку для &quot;-ЭКОНОМИЧЕСКОЕ&quot; исследования, для восстановления начальной потомства, так и для систематического исследования этой клеток-предшественников.

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Для очистки от зиготы<em&gt; S. CEREVISIAE</em&gt;, Гаплоидные клетки противоположного типа спаривания были спроектированы, чтобы выразить красного или зеленого флуоресцентного белка, инкубируют, чтобы образование зиготы, и фракционированного помощью проточной цитометрии на основе протокола. Очень обогащенные фракции позволяет последующие &quot;-ЭКОНОМИЧЕСКОЕ&quot; исследования, восстановление начальных потомство, и систематическое исследование зиготы морфогенеза.

Проточной цитометрии на основе очистки<em&gt; S. CEREVISIAE</em&gt; Зиготы

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Анализ для адгезии и агар Вторжение в CEREVISIAE С.

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Высокой пропускной метод глобально исследования морфологии органелл в CEREVISIAE С.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Идентификация белковых комплексов с количественной протеомики в CEREVISIAE С.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Проточной цитометрии Очистка мыши мейоза клетки

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Изучение, зависящими от возраста геномной нестабильности использованием С. CEREVISIAE Хронологические Модель продолжительность жизни

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Выражение и очистка муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости белка в Saccharomyces CEREVISIAE

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Оптимизирован Окрашивание и распространения методов моделирования для деления клеток Мониторинг использования красителей сотовых слежения

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Высокая пропускная Микроинъекции из морского ежа зиготы

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Очистка муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости белка выражается в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...