Name: flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Agradecemos al Dr. R. Michael Sramkoski ayuda con la citometría de flujo, el Dr. Purnima Jaiswal y el Dr. Wu Di de entrada temprano y Aylyarov Ilya ayuda con las ilustraciones. Apoyado por el NIH Grant R01GM089872 y la Citometría y Microscopia de imágenes facilidad de la base de la sentencia de Centro Integral del Cáncer (P30 CA43703).

1. Crecimiento célula haploide <ol><li> Crecer S. células de Saccharomyces desde el fondo S288C (BY4741) bajo condiciones estándar 10. </li><li> Transformar haploides para expresar cualquiera de los dos marcadores fluorescentes visibles 10. Los marcadores de elección son GFP soluble expresada en el citoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearizado con BglII 11) y una proteína ribosómica único, RPL25, fusionado con mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, de A. Johnston). Esperamos ...

<ol>
	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

La disponibilidad de los cigotos purificados debería facilitar los estudios bioquímicos incluyendo transcriptómica, proteómica y lipidómica, así como la investigación de los mecanismos por los cuales se someten a cigotos ciclo celular de re-entrada, la remodelación de la pared celular, características de florecimiento y la herencia, etc Alternativamente, los cigotos se podría generar a partir con cepas portadoras de mutaciones características en uno o ambos padres. Además, los cigotos purificados, como para ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo / Equipo </td><td> Fuente </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, que codifica GFP citoplasmática 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, RPL25 codificación fusionado a mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonicador </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Polipropileno tubo con tapa colador </td><td> BD Falcon </td><td> Ref. 352235 </td></tr><tr><td> Microcentrífuga refrigerada </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> La citometría de flujo vaina solución </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> Reflexión iCyt Modelo Citometría de Flujo </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision deconvolución microscopio </td><td> Applied Precision </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de epifluorescencia vertical </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure agarosa </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> CSM formulación glucosa Notas: Para las placas de agar, simplemente incluyen 2% de agar (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Los cigotos son intermediarios esenciales entre haploides y diploides estados en el ciclo de vida de muchos organismos, incluyendo la levadura (Figura 1) 1. S. cerevisiae cigotos resultado de la fusión de células haploides de tipo de apareamiento diferente (MATa, MATalpha) y dan lugar a las correspondientes diploides estables que, sucesivamente, generar tantos como 20 progenie diploide como resultado de sus divisiones mitóticas sorprendentemente asimétricos 2. Formación de cigoto está orquestada por una compleja secuencia de eventos: En este proceso, los factores solubles de acoplamiento se unen a los receptores cognados, provocando mediadas por el receptor cascadas de señalización que facilitan la interrupción del ciclo celular y culminan en la fusión célula-célula. Los cigotos se puede considerar un modelo para progenitor o función de células madre. Aunque se ha aprendido mucho acerca de la formación de cigotos y aunque cigotos se han utilizado para investigar las células moleculares preguntas de interés general sigicance, casi todos los estudios han hecho uso de mezclas de apareamiento en el que los cigotos se entremezclan con una mayoría de la población de células haploides 3-8. Muchos aspectos de la bioquímica de la formación del cigoto y la vida continua del cigoto por lo tanto permanecen sin investigar. Informes de purificación de cigotos levadura describir protocolos basados ​​en sus 9 unidades de sedimentación, sin embargo, este procedimiento sedimentación basada no cedió casi un 90% de pureza en nuestras manos. Además, tiene la desventaja de que las células se exponen a hipertónica sorbitol. Por lo tanto hemos desarrollado un procedimiento de purificación versátil. Para este propósito, pares de células haploides que expresan proteínas fluorescentes rojas o verdes se co-incubaron para permitir la formación de cigoto, se recogieron en diversos momentos, y los zigotos resultantes se purificaron utilizando una citometría de flujo basada en protocolo de clasificación. Esta técnica proporciona una evaluación conveniente visual de la pureza y la maduración. La pureza mediade la fracción es de aproximadamente 90%. De acuerdo con el momento de la cosecha, los cigotos de diferentes grados de madurez se puede recuperar. Las muestras purificadas proporcionar un punto conveniente de partida para &quot;-ómicas&quot; estudios, para la recuperación de la progenie inicial, y para la investigación sistemática de esta célula progenitora.

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Para purificar de cigotos<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;, Las células haploides de tipo de apareamiento opuesto fueron diseñados para expresar proteínas fluorescentes rojas o verdes, co-incubadas para permitir la formación de cigoto, y se fraccionó utilizando una citometría de flujo basado en el protocolo. La fracción altamente enriquecida permite subsiguiente &quot;-ómicas&quot; los estudios, la recuperación de la progenie inicial y la investigación sistemática de la morfogénesis cigoto.

Citometría de flujo basado Purificación de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Los cigotos

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Ensayo de adhesión y la invasión de agar en S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Investigación

Biología

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

El estudio de dependientes de la edad de Inestabilidad Genómica con el S. cerevisiae Cronológica Modelo Longevidad

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

La purificación de la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana de proteínas expresadas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...