Name: flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Vi tackar Dr R. Michael Sramkoski för hjälp med flödescytometri, Dr Purnima Jaiswal och Dr Di Wu för tidigare inmatning och Ilya Aylyarov för hjälp med illustrationerna. Med stöd av NIH Grant R01GM089872 och Cytometry &amp; Imaging Mikroskopi Core Facility för mål Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).

1. Haploid Celltillväxt <ol><li> Grow S. cerevisiae celler från S288C bakgrund (BY4741) under normala förhållanden 10. </li><li> Förvandla haploider att uttrycka en av två iögonfallande fluorescerande markörer 10. Markörerna av val är lösliga GFP uttrycks i cytoplasman (pEG220, URA3/YIp, linjäriserad med Bglll 11) och en enda ribosomalt protein, RPL25, sammansmält med mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, från A. Johnston). Vi förväntar oss att motsvarande två färger r...

<ol>
	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

Tillgången på renade zygoter bör underlätta biokemiska studier med transkriptomik, proteomik och lipidomics samt undersökning av mekanismer genom vilka zygoter genomgår cellcykeln återinträde, cellvägg ombyggnad, spirande och arv egenskaper, etc. Alternativt kan zygoter genereras start med stammar som bär karakteristiska mutationer i en eller båda föräldrarna. Dessutom, de renade zygoter som för haploida eller diploida celler, kan frysas i medium innehållande 15% glycerol och senare tinas att övervaka as...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens / utrustning </td><td> Källa </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, kodande cytoplasmatisk GFP 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, kodning RPL25 smält till mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonikator </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Polypropylenrör med sil lock </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Kyld mikrocentrifug </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Flödescytometri mantel lösning </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> iCyt Reflektion Modell flödescytometer </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision deconvolution mikroskop </td><td> Tillämpad Precision </td><td></td></tr><tr><td> Upprätt epifluorescensmikroskop </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agaros </td><td> Invitrogen </td><td> 15.510-07 </td></tr><tr><td> CSM glukos formulering Anmärkningar: För agarplattor, inkluderar bara 2% agar (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Zygoter är viktiga intermediärer mellan haploida och anger diploida i livscykeln för många organismer, inklusive jäst (figur 1) 1. S. cerevisiae zygoter resultat av fusionen av haploida celler av distinkt parning typ (MATa, MATalpha) och ger upphov till motsvarande stabila diploider som successivt genererar så många som 20 diploida avkomma som ett resultat av deras påfallande asymmetriska mitotiska divisioner 2. Zygot bildning iscensatt av en komplex sekvens av händelser: I denna process lösliga parning faktorer binder till besläktade receptorer, utlöser receptor-medierad signalering kaskader som underlättar avbrott av cellcykeln och avslutas i cell-cellfusion. Zygoter kan betraktas en modell för progenitorceller eller stamceller funktion. Även om mycket har lärt sig om bildandet av zygoter och även zygoter har använts för att undersöka cell-molekylära frågor av allmänt betyicance nästan alla studier har använt sig av passande blandningar där zygoter är blandade med en majoritet population av haploida celler 3-8. Många aspekter av biokemi zygoten formation och den fortsatta livet av zygoten förblir därför outforskat. Rapporter om rening av jäst zygoter beskriver protokoll baserat på deras sedimentering egenskaper 9, men har detta sedimentering-baserade förfarandet inte ger nästan 90% renhet i våra händer. Dessutom har den nackdelen att cellerna exponeras för hypertonisk sorbitol. Vi har därför utvecklat en mångsidig reningsprocedur. För detta ändamål, var par av haploida celler som uttrycker röda eller gröna fluorescerande proteiner saminkuberades att tillåta zygot bildas, skördades vid olika tidpunkter, och de resulterande zygoter renades med användning av en flödescytometri-baserad sortering protokoll. Denna teknik ger en bekväm visuell bedömning av renhet och mognad. Den genomsnittliga renhetsgradav fraktionen är ungefär 90%. Enligt tidpunkten för skörden, kan zygoter av varierande mognad återvinnas. De renade prover ger en bekväm utgångspunkt för &quot;-miska&quot; studier för återvinning av första avkomma och för systematisk undersökning av detta stamcellstransplantation.

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

För att rena zygoter av<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Var haploida celler av motsatt parning typ för att uttrycka röda eller gröna fluorescerande proteiner, co ruvade att tillåta zygot bildas och fraktionerades med hjälp av en flödescytometri-baserat protokoll. Den mycket fraktionen kan efterföljande &quot;-miska&quot; studier, återvinning av första avkomma, och systematisk undersökning av zygot morfogenes.

Flödescytometri-baserad rening av<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygoter

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Analys för vidhäftningsförmåga och agar Invasion i S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

En hög genomströmning metod för att globalt studera organell morfologi i S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Kartläggning av protein komplex med kvantitativa proteomik i S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Flödescytometri Rening av Mouse meiotiska celler

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studera age-dependent genomisk instabilitet med S. cerevisiae Kronologisk Livslängd Modell

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression och rening av den cystisk fibros transmembran konduktans-regulator protein i Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimerade färgning och spridning modelleringsmetoder för celldelning övervakning med hjälp Färgämnen Cell Tracking

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Hög genomströmning microinjections av Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Rening av cystisk fibros transmembran konduktansregulator Protein Uttryckt i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...