Name: flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Biz çizimler ile yardım için erken giriş ve Ilya Aylyarov için flow sitometri, Dr Purnima Jaiswal ve Dr Di Wu ile yardım Dr R. Michael Sramkoski ederim. NIH hibe R01GM089872 ve Sitometri &amp; Vaka Kapsamlı Kanser Merkezi (P30 CA43703) görüntülenmesi Mikroskopi Çekirdek Tesisi tarafından desteklenir.

1. Haploid Hücre Büyümesi <ol><li> S. büyütün standart koşullar altında 10 S288C plan (BY4741) den cerevisiae hücreleri. </li><li> İki göze floresan işaretleri 10 ya ifade etmek haploidlerin Transform. Seçim marker mCherry (A. Johnston pAJ1661, URA3/CEN,) ile kaynaşmış sitoplazma içerisinde ifade edilen çözünür GFP (BgII 11 ile doğrusallaştırılmış pEG220, URA3/YIp,) ve tek bir ribozomal protein, RPL25 vardır. Biz eşdeğer iki renkli arıtm...

<ol>
	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

Saflaştırılmış zigotların durumu zigotlar Alternatif olarak hücre döngüsü yeniden giriş, hücre duvarı yeniden şekillenme, filizlenen ve kalıtım özellikleri, vs uğrayan göre transkriptomiks, proteomikler ve lipidomics yanı sıra, mekanizmalarının incelenmesi içeren biyokimyasal çalışmalar kolaylaştırması, zigotlar başlangıç ​​elde edilebilir Bir veya iki ebeveyn karakteristik mutasyonlar taşıyan suşlar ile. Bundan başka, arıtılmış zigotlar, haploid veya diploid hücrelerde içi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Ekipman </td><td> Kaynak </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, kodlama sitoplazmik GFP 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, mCherry erimiş kodlama RPL25 </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 sonikatör </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Süzgeçli kapaklı polipropilen tüp </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Soğutmalı mikrofuge&#39;de </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Flow sitometri kılıf çözümü </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> iCyt Yansıma Modeli Akış Sitometresi </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision ters evrişim mikroskop </td><td> Uygulamalı Precision </td><td></td></tr><tr><td> Dik Epifloresans mikroskop </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Agaroz </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> CSM glukoz formülasyon Notlar: agar plakaları için, sadece% 2 agar (Difco) içerir </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Zigot maya dahil birçok organizmanın yaşam döngüsü içinde haploid ve diploid devletler arasındaki temel ara ürünler, (Şekil 1) 1. S. vardır cerevisiae farklı çiftleşme tipi (mata, MATalpha) haploid hücre füzyon sonucu zigotlar ve birbirlerinin çarpıcı bir asimetrik mitotik bölünmeleri 2 bir sonucu olarak en çok 20 diploid soy oluşturmak uygun stabil diploid neden olmaktadır. Zigot oluşum olaylar kompleksi sekans tarafından yönetilir: Bu işlemde, çözünür çiftleşme faktör hücre-hücre füzyon hücre döngüsü ile sonuçlanan bir kesinti kolaylaştırmak reseptör-kaynaklı sinyalleme kaskadını tetikleme, aynı soydan gelen reseptörlere bağlanır. Zigot progenitör veya kök hücre fonksiyonu için bir model olarak kabul edilebilir. Çok zigot oluşumu hakkında öğrendim olmasına rağmen ve zigot genel anlaml hücre-moleküler soruları araştırmak için kullanılmış olmasına rağmenicance, hemen hemen tüm çalışmalarda zigot 3-8 haploid hücrelerin bir çoğunluk nüfusu ile karışmış olduğu çiftleşme karışımların kullanımı yaptık. Zigot oluşumunun biyokimyasında pek çok yönü ve zigot devam ömrü böylelikle araştırılmamış kalır. Maya zigot arıtma Raporları, çökelme özellikleri 9 dayanan protokolleri açıklar, ancak bu sedimantasyon tabanlı prosedürü elimizde yaklaşık% 90 saflıkta vermemiştir. Bundan başka, hücrelerin hipertonik sorbitol maruz kaldığı dezavantajı vardır. Bu nedenle çok yönlü bir arınma prosedürü geliştirdik. Bu amaç için, kırmızı veya yeşil floresan protein eksprese eden bir çift haploid hücrelerde zigot oluşumu, çeşitli zamanlarda toplanır ve sonuçta ortaya çıkan zigot bir akış sitometrisi tabanlı bir sıralama protokol kullanılarak saflaştırılmıştır izin vermek için birlikte inkübe edildi. Bu teknik, saflık ve olgunlaşma uygun bir görsel değerlendirme sağlar. Ortalama saflığıfraksiyonu yaklaşık% 90&#39;dır. Hasat zamanlama göre, vadesi değişen derecelerde zigot telafi edilebilir. Saflaştırılmış örnekleri ilk döl kurtarma ve bu progenitör hücre sistematik olarak incelenmesi için, &quot;-omic&quot; çalışmaları için çıkış uygun bir nokta sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes at JoVE.com

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Arasında zigot arındırmak için<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Karşısında çiftleşme tipi haploit hücreler flow sitometri tabanlı bir protokol kullanarak kırmızı veya yeşil floresan zigot oluşumunu sağlamak için işbirliği İnkübe proteinler, ve fraksiyone ifade geliştirilmişti. Yüksek oranda zenginleştirilmiş fraksiyonu ilk döl müteakip &quot;-omic&quot; çalışmaları, kurtarma ve zigot morphogenesis sistematik araştırma sağlar.

Akış Sitometri tabanlı Arıtma<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigot

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

S. cerevisiae yapışma ve Agar Invasion için Testi

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Deniz Kestanesi Zigotlar Yüksek Randımanlı Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...