Name: facilitating drug discovery: an automated high-content inflammation assay in zebrafish
Uploaded: 2012-07-16T13:00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish at JoVE.com

<p class="jove_content"&gt; Vi takker Nadeshda Wolf, Nadine Eschen og Susanne Delong for utmerket dyrehold. CW ble støttet av en PhD fellesskap fra Helmholtz programmet &#39;<em&gt; BioInterfaces</em&gt; International Graduate School &quot;(BIFIGS). Ytterligere støtte ble gitt av en KIT-RISC stipend og av en Marie Curie International Reintegration Grant i syvende europeiske fellesskapet rammeprogram (PIRG07-GA-2010-267552) til CG. AHS ble støttet av BOLD (Biology of leveren og bukspyttkjertelen Utvikling og sykdom) - Marie Curie Initial Training Network (238821). UL ble støttet av Dopaminet 7RP (Syvende rammeprogram) (223744).</p&gt;

1. Animal Håndtering For Chin analysen bruken 3 DPF larver som følge av konsernets parringer mellom homozygot dobbelt transgene cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 og AB (villtype) fisk. Samle embryoer ved naturlig gyting og heve dem ved 29 ° C i E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, og 0,1% metylenblått, likevekt til pH 7,0) i petriskåler. Det er viktig å opprettholde en tetthet av embryoer ikke overstiger 50-70 per plate. 2. Larve Sortering Sjekk alle larver under en fluorescens stereoscope for fluoriserende reporter uttrykk, spontan betennelse og hensiktsmessig aldersrelatert utvikling. 3. Screening Medium Forberedelse (alltid forberede fersk) Forbered E3 medium uten metylenblått supplert med DMSO (1% final) og MS222 (0,05 g / l). 4. CuSO4Forberedelse (alltid forberede fersk) Først veie ut CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) og forberede en 20 mM stamløsning i dH 2 O. Forbered 120 mM CuSO 4 arbeidsdager løsning (fra 20 mM stamløsning) i E3/DMSO (1%) / MS-222. Beskytt CuSO 4 løsning mot lys. 5. 384-brønnen Plate Forberedelse (Greiner 384 Well Mikroplate) Pre-add 20 mL av E3/DMSO (1%) / MS-222 til hver brønn med en omvendt pipette. En økt pipettespissen boring er nødvendig for å håndtere de embryoene forsiktig uten å påføre noen såret, dette gjøres ved å kutte spissen til en 2 mm bar. Overfør enkelt larve i 74 mL av middels til hver brønn (84 mL for ubehandlet kontroll). Om nødvendig, orientere larver i en lateral posisjon innenfor brønn med fleksibel Eppendorf Microloader pipettespissen (Eppendorf, 5242 956.003). Gjennomføre alle følgende væskehåndtering trinn med en robot væskehåndtering arbeidsstasjon for å sikre samtidig behandling av alle larver. 6. Medikamentell behandling Bland forbindelser i stoffet lager plate 5 ganger med pipettering opp og ned. Legg 16 mL av 7,5 x narkotika lager plate til hver brønn og bland 5 ganger. Juster tips posisjon innen brønner for å hindre skade av larver og dispensere mediet ved 10 mL / s. Bland medium i brønner 4 ganger for å sikre homogen fordeling av stoffet i brønnen. 7. Inkubasjon Inkuber screening plate i 1 time ved 29 ° C dekket med aluminiumsfolie for å beskytte forbindelser samt CuSO 4 fra lys. 8. Kjemisk såret Tilsett 10 mL av 120 mM CuSO 4 arbeider løsning til hver brønn unntatt til negative kontroller, mix 4 ganger og inkuber igjen i 1 time ved 29 ° C. 9. Vaske Fjern og utveksle 80 mL av meg<html> DIUM fra hver brønn to ganger (i 20 mL trinn) for å fjerne forbindelser og CuSO 4. 10. Image Acquisition Begynn bilde oppkjøpet på en invertert automatisert mikroskop (dvs.: Olympus scan ^ R) 90 minutter etter første kobber behandling. Angi første z-nivå slik at neuromasts fra høyre og venstre bakre sidelinje er synlige. Bildet hver brønn gang per time i kanalene lysfelt, Cy3 og GFP i 4 kontaktpunkter fly (50 mikrometer avstand) med en 4x objektiv (NA = 0,13). Ytterligere informasjon om bildet og databehandling er tilgjengelig på forespørsel. 11. Bildebehandling 1. Datasortering Rå Bildene behandles med vår skikk LabView programvare skript. Den første operasjonen i bildebehandlingen rørledningen er sortering av rå bilder fra mikroskop generert data mappe ved kanalen, godt og tid-point informasjon. ove_step &quot;&gt; 2. Utvidet fokus Deretter programvare skaper utvidet fokus bildene fra 4 knutepunkter fly for hver av kanalene. 3. RGB-overlay I et siste trinn de utvidede fokus bildene fra de 3 kanalene er slått sammen til resultere i en endelig RGB-overlay bilde. 4. Automatisert neuromast deteksjon Et mønster gjenkjenning verktøy (LabView Rapid IA prototyping verktøy) identifiserer neuromasts innenfor RGB overleggsbilder og skaper en empirisk definert område av interesse rundt neuromasts. 5. Kvantifisering Innenfor empirisk definert område av interesse rundt skadde neuromasts røde lysstoffrør leukocytter (reflektert som røde punkter) blir scoret resulterer i en primær avlesning av p ercent en rimelig o ccupied ved l eukocytes (Paol). I 95.27 gjennomsnitt ± 2,11% (FDA1) og 95,12 ±1,56% (FDA2) av brønner (larver) har blitt oppdaget på riktig måte og er senere blitt utsatt for ytterligere databehandling. Rådata utgang (Paol for hver funnet neuromast) er lagret i en txt-fil og fungerer som inndata for MATLAB-skript som behandler rådataene videre. 12. Data Processing 1. IMAPS Vurdere suksessen av enkelte eksperimenter med grafisk visualisering av rådata utgang Paol i en fargekode kunne realiseres med såkalte betennelser kart (IMAPS) (figur 2). Bright green reflekterer en høy første inflammatorisk indeks; svart indikerer ingen betennelse. Dette rask oversikt muliggjør rask identifisering av mislykkede eksperimenter, som deretter kan utelukkes fra videre dataanalyser. 2. Gjennomsnitt av kontroller Hver eksperimentell plate inneholder 320 forbindelser som reflekterer enenkelt datapunkt per sammensatte og tids-punkt, samt 32 positive og negative kontroller, henholdsvis. Den 32 kontroll gjentak er gjennomsnitt og standardavvik beregnes. For kontrollene eneste datapunktene innenfor 2 standardavvik er inkludert. 3. Normalisering Normalisering gjøres ved regneark analyse. Den gjennomsnittlige verdien av DMSO, som er den negative kontrollen, er satt til 0 og det høyeste gjennomsnittet Paol for kobber kontrollen er satt til 1, slik at den maksimale forskjellen mellom positiv og negativ kontroll er satt til 1. Hver sammensatte Paol er lineært interpolert eller ekstrapolert til de respektive kontroller på eksperimentelle plate. 4. Endelig lese-out: Inflammatorisk index Etter tilstrekkelig replikatmålinger eksperimenter (dvs. 15) har blitt gjennomført, er normalisert rådata fra replikatmålinger eksperimenter i gjennomsnitt, noe som resulterer i en endelig lese-out - den inflammatoriskeindeks. Den første inflammatorisk indeks av kobber kontroll starter på 100% for tid-nullpunkt og samsvarer med bildet oppkjøpet start tid (90 minutter etter første kobber behandling). 5. Monoton eksponentiell regresjon montering På grunn av betennelse oppløsning over tid vi utfører en monoton eksponentiell lineær regresjon montering mot den opprinnelige betennelse ved hjelp <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="Formel 1" /> - En 0 er et mål for den første respons ved t = 0, er en 1 relatert til skråningen av omfanget over tid. 6. 2-D egenskapsrom plott (figur 4) For å generere funksjonen plassen, er en ikke-lineær regresjon anvendt og en cluster-analyse deler funksjonen plass til karakteristiske regioner, og dermed gir automatisert identifikasjon av interessante kandidater fra ulike immun-regulerende kategoriene (anti-inflammatORY, anti-oppløsning, pro-inflammatorisk, pro-oppløsning). Alle forbindelser vises i 2-D plott basert på parametere en 0 og en 1. 13. Data Håndtering og oppbevaring Våre data håndtering rutiner lage websider for å visualisere og representere slike narkotika-skjermer som gir en rask oversikt over bildet og data foredlingsledd resultater, samt en detaljert visning når brukeren ber om 10. Myke lenker til andre relevante heterogene biologiske og kjemiske databaser er integrert, samt å gi en verdifull ressurs for komparative og romanen studier 11. Ved disse rutinene, er riktige data standarder og metainformation satt for langsiktig lagring av disse dataene. 14. Representative Resultater I en pilot skjerm analysert vi et bibliotek bestående av 640 FDA godkjente kjente bioaktive forbindelser for effekter på initiering, progresjon eller oppløsning av en granulocytic inflammatorisk respons. Basert på de observerte effektene vi klassifisert 4 typer immunmodulator fenotyper som kan tyde på ulike virkningsmekanismer: anti-inflammatorisk (1), anti-oppløsning (2), pro-inflammatorisk (3) og pro-oppløsning (4) , som kan beskrives med parametrene a 0 og 1, som oppstår fra en monoton ikke-lineær regresjon fitting (e ao ​​+ ALX -) mot den opprinnelige betennelse. Et 0 representerer omfanget av betennelsesreaksjon, mens en 1 karakteriserer helningen på kurven og dermed beskriver betennelse oppløsning. Viser alle forbindelser i en 2-D-funksjonen plass tomt (ett 1 vs en 0) åpner for automatisert identifikasjon av rammet kandidater fra de ulike immunmodulator kategorier (figur 3). 45 av 640 forbindelser som utøves betydelig anti-inflammatorisk effekt ved å redusere den initiale inflammatoriske indeksen til 50% eller mindre. Innen This kategori vi fant 6 forbindelser som tilhører den farmakologiske klasse av ikke-steroide anti-inflammatoriske legemidler (NSAIDs), som bekrefter gyldigheten av vår tilnærming. Men rangert NSAIDs ikke blant de mest potente anti-inflammatoriske legemidler. Bortsett fra de NSAIDs vi fant flere andre farmakologiske narkotika klasser som for eksempel Angiotensin reseptorblokkere (ARB), antibiotika og protonpumpehemmere. 7 forbindelser møtte empirisk definert terskel kriterier for potensielle pro-oppløsning narkotika. 18 rusmidler hatt en pro-inflammatorisk effekt, noe som resulterer i overdreven leukocytt rekruttering til skadde neuromasts forhold til de positive kontroller. Kun to forbindelser forhindret betimelig oppløsning av inflammatorisk respons. Den anti-inflammatorisk effekt av flere hit kandidater (eksemplariske kandidater fra ovennevnte farmakologiske narkotika klasser) fra piloten skjermen Could bli bekreftet i en doseavhengig måte i påfølgende sekundære Chin-analyser (data ikke vist). Retesting av 4 mulige pro-oppløsning narkotika ikke bekrefte den angitte virkningsmekanisme som utøves i den primære skjermen. 2 av narkotika hadde en svak anti-inflammatorisk potensial ved høyere konsentrasjoner (20 mm). En tredje medikament viste en marginal ikke-doseavhengig antiinflammatorisk effekt på stoff konsentrasjoner som spenner 5-20 mikrometer. Den fjerde stoffet hadde ingen effekt på inflammatorisk respons ved de konsentrasjonene som ble testet. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> Figur 1. Arbeidsflyt av haken analysen. Individuell sammensatte transgen cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larver (3 DPF) er manuelt fordelt i 384-vel mikrotiterplater. Narkotika legges samtidig i hver brønn med en Zephyr Compact Væskehåndtering Workstation. Analysen platene er så inkuberes i 1 time ved 29 ° C. Behandling med CuSO 4 </sub&gt; - Løsning (10 mM endelig konsentrasjon) for 1 t påfører den sårende og initierer en akutt betennelsesreaksjon. Endelig er kobber løsning og narkotika vasket av og automatisert bilde oppkjøpet er startet (90 minutter etter innledende kobber behandling). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> Figur 2. . Oversiktsbilde av RAW-bilder Figuren viser rå bilder av 4 kontaktpunkter fly (Z = 0 - 3) i en avstand på 50 mikrometer i kanalene Cy3 (til venstre) og GFP (til høyre), henholdsvis. Piler (Z = 1,2) indikerer eksemplariske neuromasts, pilspisser (Z = 1,2) peker klyngebaserte leukocytter rundt neuromasts. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> Figur 3. Betennelser Maps (IMAPS) Suksessen med enkelte eksperimenter kan vurderes i IMAPS reflekterer inflammatorisk respons (rådata) i en fargekode:. Bright green reflekterer en høy første infla<html> mmatory respons; svart indikerer ingen betennelse IMAPS ved endepunktet 0 (venstre) og time-punkt 5 (høyre) viser tydelig om et eksperiment som bør inngå i videre databehandling.. Kobber kontroller (rad 13 og 24) dukker opp i varierende nyanser av grønt, mens DMSO kontroll brønner (rad 1 og 12) vises i mørk grønn eller svart. På time-punkt 5, er betennelse nesten løst i kobber kontroller, nå indikert i mørke nyanser av grønn eller svart. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> Figur 4. 2-D-funksjonen plass tomt på 320 forbindelser av en FDA godkjent bibliotek og deres respektive kontroller. Alle sammensatte brønner kan vises i en 2-D-funksjonen plass plott basert på parametere en 0 og en 1, som oppstår fra et ikke-lineær regresjon montering (d/4203/4203eq1.jpg &quot;alt =&quot; Formel 1 &quot;/&gt;) mot den opprinnelige betennelse. Denne funksjonen plass tomten tillater automatisert identifikasjon av interessante kandidater som tilhører en av følgende 4 immun-regulerende kategorier som kan tyde på narkotika &#39;modusen for handling:. anti-inflammatorisk (1), anti-oppløsning (2), pro-inflammatorisk (3) og pro-oppløsning (4) <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> .

<ol>
	<li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish.">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li><li>Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+advance:+pharmacological+manipulation+of+inflammation+resolution+during+spontaneously+resolving+tissue+neutrophilia+in+the+zebrafish.">Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).</li><li>Martin, J. S., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+in+vivo+zebrafish+models+to+understand+the+biochemical+basis+of+neutrophilic+respiratory+disease.">Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).</li><li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo:+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation.">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li><li>D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemically+induced+inflammation+assay+in+zebrafish.">A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish.</a> BMC Biol. 8, 151 (2010).</li><li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line.">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li><li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciencenet'+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge.">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li><li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvester':+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources.">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

<p class="jove_content"&gt; Her presenterer vi en helautomatisk high-throughput screening strategi muliggjør identifisering av immun-regulerende stoffer i en hel dyr sammenheng. Dermed tillater overvåking av en akutt betennelsesreaksjon<em&gt; In vivo</em&gt; Og i sanntid.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Vi gir en protokoll for å søke sebrafisk som en verdifull modell organisme for medisiner eller narkotika gjenbruk innsats, ettersom stoffet effekter på leukocytt rekrutteringen til sår kan bli studert med relativ letthet i sammenheng med en fullt funksjonell medfødte immunforsvaret. Den unike fordelen av vår tilnærming er at kjemisk såret gjengir manuell larver manipulasjon foreldet, og dermed tillater automatisering og screening i en high-throughput format.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; I tillegg kan uønskede eller toksiske virkninger av rusmidler samt sterk off-target effekter enkelt vurderes med den foreslåtte oppsettet. FDA godkjente Biblioteket imidlertid ikke inneholde noen giftige forbindelser ved den gitte screening konsentrasjoner. Likevel foreslår vi for tilsynelatende giftige forbindelser for å sammenligne den tilgjengelige datasettet (f.eks immunmodulator fenotype, narkotika konsentrasjon) mellom medlemmer av samme farmakologiske stoffet klasse stede i testet biblioteket. Giftig medlemmer av et stoff familie, som ellers utøver en lovende immunmodulator fenotype, kan den prøves ved lavere konsentrasjoner, hvis behovet være.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Vi har demonstrert muligheten for å kategorisere narkotika automatisk i henhold til deres utøvde immun-regulerende effekt. Legemidler som hører til kategorien av anti-inflammatoriske stoffer kan valideres i uavhengige eksperimenter, de fleste av forbindelsene øve sin virkning i en doseavhengig måte. Fire forbindelser identifisert som potensielle pro-oppløsning narkotika kan så langt ikke bekreftes som sådan. Det indikerer også at dette immunmodulator kategori er vanskelig å beskrive, siden ingen medikamenter utelukkende påvirker oppløsning, har så langt blitt beskrevet i litteraturen. Imidlertid viste 3 av de 4 retested narkotika en anti-inflammatorisk trend ved høyere molar konsentrasjon. Optimalisere de empirisk definerte terskelen kriterier bør bidra til å redusere antallet falske-positive.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Videre tilbyr presenterte teknikken muligheten skal benyttes for identifikasjon av mutasjoner i gener som påvirker leukocytter trekkadferden<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Avsluttende, den foreslåtte metoden kan lette og akselerere medisiner eller narkotika gjenbruk innsats ved å gi etter potensielle nye bly strukturer med lett tilgjengelig informasjon om narkotika toleranse, giftighet, dosering samt potensielle off-target effekter. Derfor fungerer som en enkel, kostnadseffektiv og tidsbesparende strategi på tidlige stadier av narkotika utvikling.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Dimethyl sulphoxide </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> Kobber (II) sulfat vannfri </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> FDA godkjente stoffet bibliotek </td><td> Enzo og biovitenskap </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 mikrobrønnplate plate Uforbindtlig, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781906 </td><td> svart </td></tr><tr><td> Olympus scan ^ R </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zephyr Compact Væskehåndtering arbeidsstasjon </td><td> Caliper </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitating drug discovery: an automated high-content inflammation assay in zebrafish

Sebrafisk larver er spesielt mottagelig for hele dyret lite molekyl skjermer 1,2 grunn av sin lille størrelse og relativ enkel manipulasjon og observasjon, samt det faktum at stoffene kan bare legges til badevann og opptas når det gis i en &lt;1% DMSO løsning. På grunn av den optiske klarhet i sebrafisk larver og tilgjengeligheten av transgene linjer uttrykker fluorescerende proteiner i leukocytter, sebrafisk tilby den unike fordelen av å overvåke en akutt betennelsesreaksjon i vivo. Følgelig har utnyttelse av sebrafisk for høyt innhold små molekyl skjermer som tar sikte på identifisering av immun-regulerende forbindelser med høy gjennomstrømning blitt foreslått 3-6, noe som tyder på betennelse induksjon scenarier f.eks lokaliserte hakk i fin vev, laser skade rettet mot eggeplomme overflaten av embryoer 7 eller tailfin amputasjon 3,5,6. Den store ulempen av disse metodene ble imidlertidkravet om manuell larve manipulasjon å indusere såret, og dermed hindre high-throughput screening. Innføring av kjemisk indusert inflammasjon (Chin) assay 8 eliminert disse hindrene. Siden såret er påført kjemisk antall embryo som kan behandles samtidig er tilnærmet ubegrenset. Midlertidig behandling av sebrafisk larver med kobber sulfat induserer selektivt celledød i hårcellene i sidelinje systemet og resulterer i rask granulocytt rekruttering til skadde neuromasts. Inflammatorisk respons kan følges i sanntid ved hjelp av sammensatte transgen cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 6,9 sebrafisk larver som uttrykker en grønn fluorescerende protein i neuromast celler, samt et rødt fluoriserende protein merking granulocytter. For å utarbeide en screening strategi som ville tillate både høy-innhold og high-throughput analyser vi introdusert robot væske håndtering og kombinerte automatisert microscopy med et egendefinert utviklet programvare skript. Dette skriptet gjør automatisert kvantifisering av inflammatorisk respons ved å score det prosent området okkupert av røde fluorescerende leukocytter innenfor en empirisk definert område rundt skadde grønne fluorescerende neuromasts. Videre vi automatisert databehandling, håndtering, visualisering og lagring alt basert på tilpasset utviklet MATLAB og Python-skript. I korte trekk, innfører vi en automatisert HC / HT skjermen som gjør testing av kjemiske forbindelser for deres effekt på initiering, progresjon eller oppløsning av en granulocytisk inflammatorisk respons. Denne protokollen serverer et godt utgangspunkt for flere grundige analyser av narkotika mekanismer og stier involvert i orkestrering av en medfødte immunforsvaret. I fremtiden kan det hjelpe å identifisere utålelige giftige eller off-target effekter ved tidligere faser av medisiner og dermed redusere prosessuelle risiko og kostnader for legemiddelutvikling.

Watch this Scientific Journal Video about Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish at JoVE.com

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Her beskriver vi en roman høyt innhold kjemisk indusert inflammasjon analysen sikte på identifisering av immun-regulerende bioactives. Vi har klart å kombinere automatisert mikroskopi med tilpassede utviklet programvare skript som gjør det mulig automatisert kvantifisering av betennelsesreaksjon, samt videre databearbeiding, analyse, gruvedrift, og lagring.

Tilrettelegging Drug Discovery: En automatisert høyt innhold Betennelse Assay i sebrafisk

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Bruke Egg fra<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Som en<em&gt; In vivo</em&gt; Modell av Helminth-indusert lungebetennelse

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Analyser for identifisering av nye antivirale midler mot blåtungevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fenotypisk analyse for kvantifisering av intracellulær mykobakterier tilpasset høygjennomstrømning / screening av høyt innhold

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Høy gjennomstrømming Kvantitativ Real-time RT-PCR-analyse for fastsetting Expression Profiler av type I og III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

En optimalisert metode for å isolere og utvide Invariant Natural Killer T-celler fra mus Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering av en High-throughput Oppsett for screening små molekyler som modulerer c-di-GMP signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Måling av Influensa neuraminidase Inhibering antistofftitere ved enzym-bundet lektin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Induksjon av en betennelsesreaksjon i Primær hepatocytter kulturer fra Mus

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum bindingsassay som forutsier medikamentpenetrering i Tuberkulose Lesjoner

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...