Name: isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue
Uploaded: 2012-07-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue at JoVE.com

Мы выражаем свою признательность Marcelo Торо за помощь с проточной цитометрии. Работа выполнена при поддержке шведского сердца и легких фонда, Комиссии ЕС FP7 &quot;CardioCell&quot; Шведский исследовательский совет, AFA страхования и ALF. Б. был поддержан Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Выделение сердечного ядра <ol><li> Пальто ультрацентрифуге труб (Beckman пробирок # 363664) с 10 мл 1% BSA / PBS покрытие решение. Закройте трубы, и пусть они вращаются в течение 30 минут в трубке ротатора. Удалите покрытие решение, и пусть пробирок воздух сухой (одна трубка в сердце мыши требуется для а...

<ol>
	<li>Ang, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart.">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).</li><li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover.">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).</li><li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Cardiomyocyte+Renewal+in+Humans.">Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans.</a> Science. 324, 98-102 (1126).</li><li>Walsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation.">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation.</a> Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).</li><li>Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+cardiomyocyte+DNA+content,+ploidy+level+and+nuclear+number+in+mammalian+hearts.">Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts.</a> Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).</li><li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content,+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction.">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).</li><li>Adler, C. P., Friedburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+DNA+content.+ploidy+level+and+cell+number+in+geriatric+hearts:+postmortem+examinations+of+human+myocardium+in+old+age.">Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age.</a> Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).</li><li>Dubois, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 29, 1011-1018 (2011).</li><li>Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 7, 61-66 (2010).</li><li>Fransioli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+c-kit-Positive+Cell+Response+to+Pathological+Challenge+in+the+Myocardium.">Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium.</a> Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).</li><li>Elliott, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKX2-5(eGFP/w)+hESCs+for+isolation+of+human+cardiac+progenitors+and+cardiomyocytes.">NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).</li><li>Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Cardiomyocyte+Repopulation+by+Extracardiac+Progenitors+in+Transplanted+Human+Hearts.">Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts.</a> Circulation Research. 90, 634-640 (2002).</li><li>Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+proteins+form+an+insoluble+perinuclear+matrix+during+muscle+cell+differentiation.">Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation.</a> BMC cell biology. 10, 28 (2009).</li><li>Spoelgen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometry-based+technique+to+measure+adult+neurogenesis+in+the+brain.">A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain.</a> Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).</li><li>Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+DNA+synthesis+and+binucleation+during+murine+development.">Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development.</a> The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).</li><li>Olivetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+cardiac+hypertrophy+and+ischemic+cardiomyopathy+do+not+affect+the+proportion+of+mononucleated+and+multinucleated+myocytes+in+the+human+heart.">Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).</li><li>Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue.">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Nuclei+Isolation+from+Human+Postmortem+Brain+Tissue.">Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (20), e914 (2008).</li></ol>

Точная идентификация ядер кардиомиоцитов имеет решающее значение для анализа регенеративных процессов в миокарде 2,3. Обычные методы, чтобы изолировать кардиомиоцитов из свежей ткани в основном на основе ферментативного переваривания белки внеклеточного матрикса и последующе?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Лизирующего буфера </td></tr><tr><td> Название реагента </td></tr><tr><td> 0,32 М сахарозы </td></tr><tr><td> 10 мМ Трис-HCl (рН = 8) </td></tr><tr><td> 5 мМ CaCl 2 </td></tr><tr><td> 5 мМ ацетат магния </td></tr><tr><td> 2,0 мМ ЭДТА </td></tr><tr><td> 0,5 мМ EGTA </td></tr><tr><td> 1 мМ DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 2. Сахароза буфер </td></tr><tr><td> Название реагента </td></tr><tr><td> 2,1 М сахарозы </td></tr><tr><td> 10 мМ Трис-HCl (рН = 8) </td></tr><tr><td> 5 мМ ацетат магния </td></tr><tr><td> 1 мМ DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 3. Ядер хранения буфера (NSB плюс) </td></tr><tг&gt; <td> Название реагента </td></tr><tr><td> 0,44 М сахарозы </td></tr><tr><td> 10 мМ Трис-HCl (рН = 7,2) </td></tr><tr><td> 70 мМ KCl </td></tr><tr><td> 10 мМ MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1,5 мМ спермина </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Реактивы и оборудование </td><td> Компания </td></tr><tr><td> Изотип кролика IgG-CHIP класса, # ab37415 </td><td> Abcam </td></tr><tr><td> Кролик анти-PCM-1 антител, # HPA023374 </td><td> Атлас Антитела </td></tr><tr><td> Осел сек. антитела, анти-кролик Alexa Fluor 488, #-21206 или эквивалент сек. флуоресцентных антител </td><td> Life Technologies </td></tr><tr><td> DRAQ5 </td><td> Biostatus </td></tr><tr><td> ячейки сита 30 мкм, 70 мкм и 100 мкм </td><td> BD Biosciences </td></tr><tr><td> Стекло douncer (40 мл) ипестик &quot;L&quot; </td><td> VWR (Уитон Industries Inc) </td></tr><tr><td> Т-25 Ultra-Turrax Гомогенизатор </td><td> IKA Германии </td></tr><tr><td> Диспергирование инструмент S25 N-18 G </td><td> IKA Германии </td></tr><tr><td> Бекман Avanti центрифуги </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Сокол трубы 15 мл и 50 мл </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Бекман пробирок # 363664 </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> JS13.1 свободного качания ротора </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Приток цитометр </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Труба Rotator </td><td> VWR </td></tr></tbody></table>

isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue

Идентификация ядер кардиомиоцитов была сложной в срезах тканей большинство стратегий полагаться только на цитоплазматических белков-маркеров 1. Редкие события в кардиомиоциты, таких как пролиферации и апоптозе требуют точной идентификации сердечных миоцитов ядер для анализа клеточного обновления в гомеостаза и при патологических состояниях 2. Здесь мы предлагаем метод, чтобы изолировать ядер кардиомиоцитов из тканей после смерти путем осаждения и плотность immunolabeling с антителами против pericentriolar материала 1 (PCM-1) и последующая сортировка проточной цитометрии. Эта стратегия обеспечивает высокую пропускную способность и анализ изоляцией с преимуществом работы одинаково хорошо на свежем ткани и замороженных архивных материалов. Это позволяет изучать материалы уже собраны в биобанках. Этот метод применим и испытан в широком диапазоне видов и пригодны для нескольких ниже приложений, таких как углерод-14 знакомства 3, клетка-суCLE анализа 4, визуализация тимидина аналогов (например, BrdU и ПИН) 4, транскриптом и эпигенетических анализа.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue at JoVE.com

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Сердечная ядра изолированы с помощью осаждения и плотность immunolabeled с антителами против pericentriolar материал 1 (PCM-1) определить и сортировать ядер кардиомиоцитов с помощью проточной цитометрии.

Выделение ядер кардиомиоцитов с Посмертные тканей

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Изоляция по правам островки из не вполне Pancreatectomized Пациенты

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Выделение стволовых клеток рака из образцов предстательной железы человека

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Выделение и профилирование микроРНК содержащих экзосомы от человека Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

Стратегий выборки и обработки образцов ткани биобанка из свинины биомедицинской модели

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Изоляция предсердий миоцитов от взрослых мышей

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Электромеханическая оценка оптогенетически модулированной кардиомиоцитной активности

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Модель ишемической болезни сердца и видео-сравнение кардиомиоцитов схватки с использованием hiPSC-производных кардиомиоцитов

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Выделение жизнеспособных адипоцитов и стромально-васкулярной фракции из висцеральной жировой ткани человека, пригодных для анализа РНК и фенотипирования макрофагов

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

Получение некардиомиоцитарной клеточной суспензии для секвенирования одноклеточной РНК из сердца взрослой мыши после инфаркта миокарда

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...