Name: differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation
Uploaded: 2012-10-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av Pilot och genomförbarhetsstudien bidrag från UCLA-CURE Center, Crohns och kolit Foundation of America Karriärutveckling Award (# 2691) och National Institute of Health NIDDK K01 (DK084256) finansiering Hon Wai Koon. Benmärg bestrålning operationen hjälp av Bernard Levin och Scott kök av UCLA Center for AIDS Research mus / human Chimera core facility. Flödescytometri drift fick hjälp av UCLA Vector Core Facility.

1. Innan-du-start tekniska överväganden <ol><li> Vi rekommenderar att du använder både C57/BL6 vildtyp möss och möss knockout för experiment eftersom möss med motsvarande cd-molekyler kan köpas från de stora mus leverantörer. </li><li> Eftersom det är svårt att spåra vildtyp möss och möss knockout härledda givarceller efter benmärgstransplantation, är det nödvändigt att använda CD45.1 möss för att representera vildtypsmöss. (CD45.1 C57/SJL WT möss Jackson Laboratories lager # 002.014). </li><...

<ol>
	<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).</li><li>Ungaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Toll-like+receptor+4+antagonist+antibody+ameliorates+inflammation+but+impairs+mucosal+healing+in+murine+colitis.">A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).</li><li>Castagliuolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+neurokinin-1+receptor+during+colitis+in+mice:+role+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor.</a> Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).</li><li>Koon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathelicidin+signaling+via+the+Toll-like+receptor+protects+against+colitis+in+mice.">Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice.</a> Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).</li><li>Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+cells+in+murine+colitis:+multi-signal+analysis+confirms+pericryptal+myofibroblast+engraftment+without+epithelial+involvement.">marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement.</a> PLoS One. 6, e11 (2011).</li><li>Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+therapy+using+bone+marrow-derived+stem+cells/endothelial+progenitor+cells+to+accelerate+neovascularization+in+healing+of+experimental+ulcerative+colitis.">New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis.</a> Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).</li><li>Valcz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+aggregates+may+contribute+to+the+migration+and+epithelial+commitment+of+bone+marrow-derived+cells+in+colonic+mucosa.">Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa.</a> J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).</li><li>Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+bone+marrow-derived+monocytes/macrophages+in+the+repair+of+mucosal+damage+caused+by+irradiation+and/or+anticancer+drugs+in+colitis+model.">Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model.</a> Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).</li><li>Bakhautdin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+macrophage-derived+ceruloplasmin+in+inflammatory+bowel+disease.+.">Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. .</a> Gut. , (2012).</li><li>Seta, N., Kuwana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+multipotent+progenitors+from+human+circulating+CD14++monocytes.">Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes.</a> Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).</li><li>Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+bone+marrow+cells+generate+new+brain+cells.">Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells.</a> J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).</li><li>Finnberg, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+and+antitumor+effects+of+GFP(+)+bone+marrow-derived+cells+homing+to+syngeneic+mouse+colon+tumors.">High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors.</a> Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).</li><li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).</li><li>Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+dose+correlates+with+the+speed+of+immune+reconstitution+after+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation.</a> Blood. 103, 4344-4352 (2004).</li></ol>

Denna benmärgstransplantation tillvägagångssätt är lämpligt för immunologi forskning av kolit, infektion, cancer, fetma och andra sjukdomar. Denna benmärgstransplantation experiment behövs när genen av intresse uttrycks i båda härledda benmärg och icke-benmärg härledda celler och genen av intresse misstänks förmedla sjukdom av celler från endera populationen. Exempelvis antimikrobiell peptid cathelicidin visats modulera akut kolit. Men det uttrycks i både epitelceller och immunceller (såsom makrofage...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Cellfärgning buffert </td><td> Biolegend </td><td> # 420201 </td></tr><tr><td> 10X RBC lysbuffert </td><td> Biolegend </td><td> # 420301 </td></tr><tr><td> FITC mus isotypkontroll </td><td> Biolegend </td><td> # 400207 </td></tr><tr><td> PE mus isotypkontroll </td><td> Biolegend </td><td> # 400211 </td></tr><tr><td> PE-anti-mus CD45.2 </td><td> Biolegend </td><td> # 109807 </td></tr><tr><td> FITC-anti-mus CD45.1 </td><td> Biolegend </td><td> # 110705 </td></tr><tr><td> Anti-mus CD16/32 blockering </td><td> Biolegend </td><td> # 101301 </td></tr><tr><td> 40 | im cellfilter </td><td> Fisherbrand </td><td> # 22363547 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><tD&gt; MP Biomedicals </td><td> # 1860454 </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Fisherbrand </td><td> # BP2425 </td></tr><tr><td> Sulfatrim (SMZ) </td><td> Qualitest </td><td> NC9242720 (Fisher) </td></tr><tr><td> Lysol IC </td><td> Andwin Scientific </td><td> NC9745686 (Fisher) </td></tr><tr><td> Vaccutainer </td><td> BD </td><td> # 8000813 </td></tr><tr><td> Mus fixeringsutrustning </td><td> Braintree Scientific </td><td> # TV-150 </td></tr><tr><td> Bestrålningsanordningen </td><td> JL Shepherd and Associates </td><td> Mark I 68A </td></tr><tr><td> Flödescytometern </td><td> BD </td><td> BD FACSCanto II </td></tr><tr><td> Flödescytometern provrör </td><td> Falcon </td><td> # 352052 </td></tr><tr><td> Digitala skjutmått </td><td> Fisherbrand </td><td> 14-648-17 </td></tr><tr><td> Hemoccult IKT </td><td> Beckman Coulter </td><td> G0328QW </td></tr&gt; </tbody></table>

differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation

För att förstå betydelsen av en gen i utvecklingen av kolit, jämförde vi svaren från vildtyp möss och gen av intresse brist möss knockout på kolit. Om genen av intresse uttrycks i båda ben härledda märgceller och icke-benmärgsceller härledda celler hos värden, men det är möjligt att differentiera rollen av en gen av intresse i ben härledda märgceller och icke-benmärg härledda celler genom benmärgstransplantation teknik. För att ändra benmärgen härledda celler genotyp av möss var den ursprungliga benmärgen hos mottagande möss förstördes av bestrålning och sedan ersätts av nya givare benmärg olika genotyp. När vildtyp möss givare benmärg transplanterades till knockout-möss, kunde vi generera knockout-möss med vildtyp genexpression i ben härledda benmärgsceller. Alternativt var när knockoutmöss donator benmärg transplanteras till vildtyp mottagare möss, vildtyp möss utan gen av intresse som uttryckerfrån benmärg härledda celler producerades. Emellertid kan benmärgstransplantation inte 100% fullständig. Därför använde vi kluster av differentiering (CD) molekyler (CD45.1 och CD45.2) som markörer för givar-och celler att spåra andelen givarens benmärg härledda celler i mottagande möss och framgång av benmärgstransplantation. Vildtyp möss med CD45.1 genotyp och knockout-möss med genotyp CD45.2 användes. Efter bestrålning av mottagande möss, var givarens benmärgsceller från olika genotyper infuseras i de mottagande mössen. När den nya benmärg regenereras att ta över dess immunitet, utmanades mössen genom kemisk agens (dextran natriumsulfat, DSS 5%) för att inducera kolit. Här har vi också visat att metoden för att inducera kolit i möss och utvärdera rollen av genen av intresse uttrycks från benmärg härledda celler. Om genen av intresse från de härledda bencellerna spelar en viktig roll i utvecklingen av sjukdomen (t.ex. E. colitis), kan fenotypen för de mottagande möss med benmärgstransplantation vara signifikant. Vid slutet av kolit experiment, benmärgen härledda celler i blod och benmärg märktes med antikroppar mot CD45.1 och CD45.2 och deras kvantitativa förhållande existerar kan användas för att utvärdera framgången med benmärgstransplantation genom flödescytometri. Framgångsrik benmärgstransplantation ska visa en stor majoritet av givare genotyp (i tid av CD-molekyl markör) över mottagare genotyp i både benmärgen och blod mottagande möss.

Om genen av intresse spelar en viktig roll i immuna celler under utvecklingen av kolit, de möss som fick benmärg av olika genotyp genom benmärgstransplantation (WT KO eller KO till WT) bör ha ett förändrat respons på DSS kolit. En av de viktigaste parametrarna för att bestämma graden av kolit är H &amp; E-färgning av kolon vävnad. Kolonvävnad struktur förändringar och tecken på inflammation kan kvantitativt utvärderas genom H &amp; E-histologi poängsystem. Kriterier för H &amp; E histologi poäng för...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation at JoVE.com

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Benmärgstransplantation ger ett sätt att ändra genotypen av ben härrör benmärgsceller. Om genen av intresse uttrycks i båda ben härledda märgceller och icke-benmärg härledda celler, kan benmärgstransplantation ändra benmärg härledda celler till en annan genotyp utan att ändra den icke-benmärg härledd cell genotyp.

Skilja funktionella roller av genuttryck från immuna och icke-immuna celler i mus Kolit av benmärgstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mätning Calpain aktivitet inom fast och levande celler med flödescytometri

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering av Funktionell Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolering, rening och märkning av benmärg hos möss Neutrofiler för funktionella studier och adoptivföräldrar Experimentera Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Härledd från benmärg Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Spårning musbenmärg Monocyter<em&gt; In Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Generering och identifiering av GM-CSF Derived Alveolära liknande makrofager och dendritiska celler från benmärg från mus

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescensaktiverad cellsortering för Rening av Plasmacytoid dendritiska celler från benmärg från mus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Identifiering och isolering av Oligopotent och härstamning-begått myeloida från mus benmärg

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

En In Vivo musmodell åtgärd naiva CD4 T-cellsaktivering, spridning och Th1 differentiering induceras av benmärgen-derived dendritiska celler

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...