Name: high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية بتمويل من المنح الصحة 1R21NS073097-01 و1R01DK082884 (JSD) ومؤسسة PIER11VCTR الوطنية منحة المعاهد.

1. جيل من خطوط الخلايا مستقرة بولكلونل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء خط جودة عالية معربا عن الخلية مستقرة قناة قير للاهتمام هو خطوة أولى هامة نحو تطوير قوية مقايسة الفرز الفائق الإنتاجية. يمكن التأسيسي K + قناة overexpression تؤدي إلى تفعيل مسا...

<ol>
	<li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy.">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129 (2008).</li><li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K++channels:+recent+advances+and+future+possibilities.">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757 (2010).</li><li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels.">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213 (2007).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291 (1998).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin:+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286 (1999).</li><li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain:+a+Mount+Everest+in+the+making.">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764 (2010).</li><li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thallium-sensitive,+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells.">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671 (2004).</li><li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and.">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094 (2009).</li><li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1,+the+renal+outer+medullary+potassium+channel.">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42 (2011).</li><li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization,+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+(Kir)+channels+with+preference+for+Kir2.3,+Kir3.x,+and+Kir7.1.">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75 (2012).</li><li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213 (2008).</li></ol>

بيانات العلاج: حالما يتم جمع البيانات، وهي خطوة مشتركة في التحليل ينطوي على تطبيع استجابة كل بئر في مضان، F، إلى قيمته الأولية في بداية التجربة، F 0. ويشار إلى هذه على أنها &quot;نسبة ثابتة&quot; ويرمز &quot;F / F 0&quot;. وفي الحالات التي يهيمن F 0 من ?...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> إينفيتروجن </td><td> V1033-20 </td><td> التتراسيكلين-محرض التعبير ناقلات </td></tr><tr><td> T-REX-HEK293 الخلايا </td><td> إينفيتروجن </td><td> R71007 </td><td> التتراسيكلين-محرض خلية خط </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / زائد الكاشف </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15338100 </td><td> كاشف ترنسفكأيشن </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA الحيوية </td><td> S11550 </td><td> وسائل الإعلام خلية ثقافة </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11965 </td><td> وسائل الإعلام خلية ثقافة </td></tr><tr><td> هيغروميسين B </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10687-010 </td><td> وسائل الإعلام خلية ثقافة </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> إينفيتروجن </td&gt; <td> R210-01 </td><td> وسائل الإعلام خلية ثقافة </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15140 </td><td> وسائل الإعلام خلية ثقافة </td></tr><tr><td> HBSS-ثنائي التكافؤ مجانا </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> خلية الغسيل </td></tr><tr><td> التربسين-0.25٪ </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> خلية التفكك </td></tr><tr><td> التتراسيكلين، حمض الهيدروكلوريك </td><td> سيجما </td><td> T9823 </td><td> الحث كاشف </td></tr><tr><td> مدال FBS </td><td> ATLANTA الحيوية </td><td> S12650 </td><td> الطلاء وسائل الإعلام </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> إينفيتروجن </td><td> F24189 </td><td> صبغ فلوري </td></tr><tr><td> بلورونيك F-127 </td><td> إينفيتروجن </td><td> P-3000MP </td><td> صبغة التحميل </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> إينفيتروجن </td><td> 14175 </td><td> مقايسة العازلة </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15630 </td><td> مقايسة العازلة </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> سيجما </td><td> S6297 </td><td> TL + التحفيز العازلة </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> سيجما </td><td> M2643 </td><td> TL + التحفيز العازلة </td></tr><tr><td> كاسو 4 • 2H 2 O </td><td> سيجما </td><td> C3771 </td><td> TL + التحفيز العازلة </td></tr><tr><td> D-غلوكوز </td><td> سيجما </td><td> G7528 </td><td> TL + التحفيز العازلة </td></tr><tr><td> كبريتات الثاليوم </td><td> الدريتش </td><td> 204625 </td><td> TL + التحفيز العازلة </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> سيجما </td><td> H4034 </td><td> TL + التحفيز العازلة </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> سيجما </td><td> D4540 </td><td> مذيب </td></tr><tr><td> ثماني قنوات إلكترونية pipettor </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> الطلاء الخلية في 384 -وحات جيدة </td></tr><tr><td> BD PureCoat أمين المغلفة 384 وحات جيدة </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 356719 </td><td> مقايسة microplates </td></tr><tr><td> تأهل صدى حسنا البولي بروبلين 384 صفيحة ميكروسكوبية (384PP) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> microplates مجمع مصدر </td></tr><tr><td> microplates البولي بروبلين 384 جيد </td><td> غرينر بيو واحد </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop موزع كومبي كاشف </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 صفيحة ميكروسكوبية غسالة </td><td> بيوتيك </td><td> ELx405HT </td><td> غسل الخلايا الآلي </td></tr><tr><td> صدى معالج السائل </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte صدى 550 </td><td></td></tr><tr><td> برافو الآلي منصة تداول السائل </td><td> اجيلنت تكنولوجيز </td><td> نموذج قياسي </td><td></td></tr><tr><td> حمامةتسو FDSS 6000 </td><td> هاماماتسو </td><td></td><td> التصوير الحركي لوحة قارئ </td></tr></tbody></table> الجدول 1. قائمة المواد والكواشف.

high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels

وافترض أعضاء معينة من البوتاسيوم المعدل الداخل الأسرة قناة (قير) أهداف المخدرات لمجموعة متنوعة من الاضطرابات، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم، الرجفان الأذيني، و1،2 الألم. بالنسبة للجزء الأكبر، ومع ذلك، فقد تم التقدم تباطأ نحو فهم إمكاناتها العلاجية أو الوظائف الفسيولوجية الأساسية حتى لعدم وجود أدوات الدوائية جيدة. في الواقع، وتأخر في علم الصيدلة الجزيئية الأسرة المعدل الداخل بعيدا وراء ذلك من الفصيلة S4 من الجهد بوابات قنوات (كيلو فولت) البوتاسيوم، والتي تم اكتشافها في عدد من تقارب-nanomolar وانتقائية للغاية جهري السم الببتيد 3. السم سم النحل tertiapin ومشتقاته ومثبطات قوية من Kir1.1 وKir3 قنوات 4،5، ولكن الببتيدات ذات الاستخدام المحدود علاجية وكذلك تجريبيا نظرا لخصائص المستضدية والتوافر البيولوجي الفقراء والاستقرار الأيضية وانتفاذ الأنسجة. تطوير قويةوسوف انتقائية الصغيرة جزيء تحقيقات مع تحسين الخصائص الدوائية تكون مفتاحا لفهم علم وظائف الأعضاء بشكل كامل والإمكانات العلاجية من القنوات قير. الجزيئية إنتاج مجسات مكتبات مركز شبكة (MLPCN) بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) قد خلق فرص الصندوق المشترك للعلماء الأكاديمية لبدء التحقيق حملات اكتشاف الجزيئية للأهداف ومسارات الإشارات في حاجة إلى أفضل الصيدلة 6. ويقدم الباحثون MLPCN الوصول إلى مراكز الفرز الصناعة على نطاق والكيمياء الطبية والمعلوماتية دعم لتطوير جزيء صغير تحقيقات لتوضيح وظيفة الجينات وشبكات الجينات. الخطوة الحاسمة في كسب الدخول إلى MLPCN هو وضع مقايسة المستهدفة أو مسار محدد، قوية قابلة للالفرز الفائق الإنتاجية (HTS). هنا، نحن تصف كيفية تطوير مضان القائم على الثاليوم (TL +) تدفق أساذ وظيفة قناة قير للفحص مجمع عالية الإنتاجية 7،8،9،10. ويستند الفحص على نفاذية K + قناة المسام ليرة تركية K + + متجانس. ويستخدم الفلورسنت المتاحة تجاريا ثاليوم + مراسل صبغ للكشف عن تدفق عبر الغشاء من ثاليوم + من خلال المسام. هناك على الأقل ثلاثة الأصباغ المتاحة تجاريا التي هي مناسبة لفحوصات + ثاليوم تدفق: BTC، FluoZin-2، 7،8 وFluxOR. يصف هذا البروتوكول باستخدام مقايسة التنمية FluoZin-2. على الرغم من أن وضعت أصلا وتسويقها كمؤشر الزنك، FluoZin-2 المعروضات زيادة جرعة قوية وتعتمد على الانبعاثات في مضان على ثاليوم + ملزمة. بدأنا العمل مع FluoZin-2 قبل FluxOR كانت متاحة 7،8 واستمرت في القيام بذلك 9،10. ومع ذلك، فإن الخطوات في تطوير الفحص متطابقة أساسا لجميع الأصباغ الثلاثة، ويجب على المستخدمين تحديد أي صبغة هي الأنسب لن الخاصةeeds. نناقش أيضا مقاييس أداء الفحص أنه يجب التوصل للنظر في الدخول إلى MLPCN. منذ ثاليوم + يتخلل بسهولة أكثر K + قنوات، ينبغي أن تكون قابلة للتكيف مع مقايسة الأهداف الأكثر K + القناة.

استخدام نظام التعبير التتراسيكلين-محرض يوفر عنصر تحكم مريحة الداخلية للتمييز ثاليوم + تدفق من خلال مسارات الذاتية وقناة قير للاهتمام. الشكل 1 يبين بعض الأمثلة من الخرائط المستخدمة في الطلاء الخلية أنواع مختلفة من التجارب. يشار إلى مواقف الآبار التي تح...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels at JoVE.com

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

يتم تقديم أساليب لتطوير والتحقق من صحة مقايسة الكمية مضان لقياس نشاط البوتاسيوم المعدل الداخل (قير) قنوات لفحص المجمع الإنتاجية العالية.

الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

اسماك الزرد نطاق واسع ، واستنادا في الجسم الحي شاشة جزيء صغير

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

والفحص الفحص نيون لتحديد المغيرون من القنوات GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

A طريقة Permeabilization من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة للفحوصات الصغيرة جزيء آخر

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

دليل جزيء صغير شاشة تقترب عالية الإنتاجية عن طريق الزرد الأجنة

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...