Name: high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par un financement du National Institutes of Health des subventions 1R21NS073097-01 et 1R01DK082884 (JSD) et la Fondation pour la PIER11VCTR instituts nationaux de subvention.

1. Génération de lignées stables de cellules polyclonales <ol><li> La mise en place d&#39;une lignée cellulaire stable exprimant de haute qualité du canal Kir d&#39;intérêt est une première étape importante vers l&#39;élaboration d&#39;un test de criblage à haut débit robuste. Constitutif canal K + surexpression peut conduire à l&#39;activation de voies de mort cellulaire, la dégénérescence lignée cellulaire stable et la perte de performance du test. Pour éviter ces problèmes potentiels e...

<ol>
	<li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy.">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129 (2008).</li><li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K++channels:+recent+advances+and+future+possibilities.">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757 (2010).</li><li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels.">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213 (2007).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291 (1998).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin:+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286 (1999).</li><li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain:+a+Mount+Everest+in+the+making.">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764 (2010).</li><li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thallium-sensitive,+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells.">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671 (2004).</li><li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and.">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094 (2009).</li><li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1,+the+renal+outer+medullary+potassium+channel.">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42 (2011).</li><li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization,+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+(Kir)+channels+with+preference+for+Kir2.3,+Kir3.x,+and+Kir7.1.">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75 (2012).</li><li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213 (2008).</li></ol>

Traitement des données: Une fois les données recueillies, une étape commune dans l&#39;analyse consiste à normaliser réponse de fluorescence de chaque puits, F, à sa valeur initiale au début de l&#39;expérience, F 0. Ceci est communément appelé le &quot;rapport statique» et symbolisé &quot;F / F 0&quot;. Dans le cas où F 0 est dominé par le colorant indicateur du fonctionnement rapport statique pour corriger sensiblement nombreux facteurs tels qu...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Vecteur d&#39;expression inductible par la tétracycline </td></tr><tr><td> T-rex-cellules HEK293 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Lignée cellulaire inductible par la tétracycline </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / Plus réactif </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Réactif de transfection </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> Blasticidine S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> HBSS-divalent gratuit </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Lavage des cellules </td></tr><tr><td> Trypsine 0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Dissociation cellulaire </td></tr><tr><td> Tétracycline-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Réactif à induction </td></tr><tr><td> FBS dialyse </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Géloses </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Colorant fluorescent </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Colorant de chargement </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Tampon de dosage </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Tampon de dosage </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> Le D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> Sulfate de thallium </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Solvant </td></tr><tr><td> Huit canaux pipette électronique </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Placage cellule en 384 -plaques à puits </td></tr><tr><td> BD PureCoat amine recouvertes de plaques 384 puits </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Microplaques de dosage </td></tr><tr><td> Echo qualifié 384-Eh bien polypropylène microplaque (384pp) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> Microplaques sources composés </td></tr><tr><td> Microplaques en polypropylène de 384 puits </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi distributeur de réactif </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> Laveur de microplaques ELx405 </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Lavage de cellules automatisé </td></tr><tr><td> Echo manipulateur de liquide </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo automatisée plate-forme de manipulation des liquides </td><td> Agilent Technologies </td><td> Modèle standard </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetic lecteur de plaque d&#39;imagerie </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Liste des Matériels et réactifs.

high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels

Certains membres de la famille redresseur canal potassique vers l&#39;intérieur (Kir) sont postulés cibles thérapeutiques pour une variété de troubles, y compris l&#39;hypertension, la fibrillation auriculaire, et de 1,2 douleur. Pour la plupart, toutefois, les progrès vers la compréhension de leur potentiel thérapeutique, voire fonctions physiologiques a été ralentie par le manque de bons outils pharmacologiques. En effet, la pharmacologie moléculaire de la famille redresseur entrant est restée loin derrière celle de la superfamille S4 de potassium voltage-dépendants (Kv), les canaux pour lesquels un certain nombre d&#39;affinité nanomolaire et très modulateurs sélectifs des toxines peptidiques ont été découverts 3. La toxine du venin d&#39;abeille tertiapin et ses dérivés sont de puissants inhibiteurs de Kir1.1 et Kir3 canaux 4,5, mais peptides sont d&#39;une utilité limitée thérapeutique ainsi que expérimentalement en raison de leurs propriétés antigéniques et la biodisponibilité médiocre, la stabilité métabolique et la pénétrance des tissus. Le développement de puissantset sélectifs de petites molécules sondes avec des propriétés pharmacologiques améliorées sera un élément clé pour bien comprendre la physiologie et le potentiel thérapeutique des canaux Kir. La moléculaire bibliothèques Sondes de production Network Center (MLPCN) supportée par le National Institutes of Health (NIH) Fonds commun a créé des opportunités pour les scientifiques académiques pour initier des campagnes de sonde de découverte de cibles moléculaires et les voies de signalisation dans le besoin d&#39;une meilleure pharmacologie 6. L&#39;offre aux chercheurs l&#39;accès MLPCN aux centres de dépistage l&#39;échelle industrielle et la chimie médicinale et de l&#39;informatique en charge de développer de petites molécules sondes pour élucider la fonction des gènes et des réseaux de gènes. L&#39;étape critique pour gagner l&#39;entrée à l&#39;MLPCN est le développement d&#39;un test robuste cible ou une voie spécifique qui est susceptible de criblage à haut débit (HTS). Ici, nous décrivons comment développer une base de fluorescence thallium (Tl +) flux assaY sur Kir canal de fonction pour le criblage à haut débit composé 7,8,9,10. L&#39;essai est basé sur la perméabilité de la chaîne K + pores de la Tl + K + congénère. Un disponibles dans le commerce fluorescent Tl + colorant reporter est utilisé pour détecter le flux transmembranaire de Tl + à travers le pore. Il ya au moins trois colorants disponibles dans le commerce qui sont appropriés pour Tl + tests de flux: BTC, FluoZin-2, 7,8 et Fluxor. Ce protocole décrit le développement de tests à l&#39;aide FluoZin-2. Bien qu&#39;à l&#39;origine développés et commercialisés comme un indicateur de zinc, FluoZin-2 présente une augmentation forte et dose-dépendante de l&#39;émission de fluorescence lors de Tl + contraignant. Nous avons commencé à travailler avec FluoZin-2 avant Fluxor était disponible 7,8 et ont continué à le faire 9,10. Cependant, les étapes de développement de tests sont essentiellement identiques pour les trois colorants, et les utilisateurs devraient déterminer quels colorant est le plus approprié pour leur propre needs. Nous discutons également des critères de performance de l&#39;analyse qui doit être atteint à prendre en considération pour l&#39;entrée à l&#39;MLPCN. Depuis Tl + imprègne facilement la plupart des canaux K +, le dosage doit être adapté à la plupart des objectifs de canaux K +.

L&#39;utilisation d&#39;un système d&#39;expression inductible par la tétracycline permet un contrôle pratique interne pour distinguer Tl + flux à travers les voies endogènes et le canal Kir d&#39;intérêt. Figure 1 montre quelques exemples de cartes de placage de cellules utilisées dans différents types d&#39;expériences. Les positions des puits contenant les cellules non induites ou induite par la tétracycline sont indiquées par des couleurs différentes. Figure 2A</stron...

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High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Méthodes d&#39;élaboration et de validation d&#39;un dosage quantitatif de fluorescence pour mesurer l&#39;activité de potassium redresseur actif (Kir) des canaux pour le criblage de composés à haut débit est présenté.

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