Name: high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00
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Diese Arbeit wurde durch Mittel aus National Institutes of Health Zuschüsse 1R21NS073097-01 und 1R01DK082884 (JSD) und der Stiftung für den National Institutes Gewährung PIER11VCTR unterstützt.

Ein. Erzeugung von stabilen polyklonalen Zelllinien <ol><li> Die Errichtung eines hochwertigen stabile Zelllinie die Kir Kanal von Interesse ist ein wichtiger erster Schritt in Richtung Entwicklung eines robusten High-Throughput-Screening-Test. Konstituierende K +-Kanal Überexpression kann zu einer Aktivierung des Zelltodes Wege, stabile Zelllinie Degeneration und Verlust der Assay-Leistung führen. Um diese potentiellen Probleme zu vermeiden und ein bequemer interne Kontrolle für die Assay-Entwicklung (s...

<ol>
	<li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy.">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129 (2008).</li><li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K++channels:+recent+advances+and+future+possibilities.">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757 (2010).</li><li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels.">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213 (2007).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291 (1998).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin:+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286 (1999).</li><li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain:+a+Mount+Everest+in+the+making.">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764 (2010).</li><li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thallium-sensitive,+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells.">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671 (2004).</li><li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and.">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094 (2009).</li><li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1,+the+renal+outer+medullary+potassium+channel.">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42 (2011).</li><li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization,+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+(Kir)+channels+with+preference+for+Kir2.3,+Kir3.x,+and+Kir7.1.">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75 (2012).</li><li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213 (2008).</li></ol>

Datenverarbeitung: Sobald die Daten gesammelt werden, ein gemeinsamer Schritt in der Analyse beinhaltet Normalisierung jedes Brunnens Fluoreszenz-Antwort, F, auf den Ausgangswert zu Beginn des Experiments, F 0. Dies wird allgemein als der &quot;statische Verhältnis&quot; bezeichnet und symbolisiert &quot;F / F 0&quot;. In Fällen, in denen F 0 von der Indikatorfarbstoff dominiert wird die statische Verhältnis Operation wird im wesentlichen für viele Faktore...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

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Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Tetracyclin-induzierbarer Expressionsvektor </td></tr><tr><td> T-Rex-HEK293-Zellen </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Tetracyclin-induzierbaren Zelllinie </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / Plus Reagent </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Transfektionsreagenz </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> HBSS-zweiwertigen kostenlos </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Waschen der Zellen </td></tr><tr><td> Trypsin-0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Zelldissoziationslösung </td></tr><tr><td> Tetracyclin-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Induction Reagenz </td></tr><tr><td> Dialysiertes FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Plattierungsmedien </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Fluoreszenzfarbstoff </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Dye Belastung </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Assay-Puffer </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Assay-Puffer </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> Thalliumsulfat </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + Stimulus-Puffer </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Lösungsmittel </td></tr><tr><td> Acht-Kanal elektronische Pipette </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Zelle plating in 384 -Well-Platten </td></tr><tr><td> BD PureCoat Amin-beschichtete 384-Well-Platten </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Assay Mikrotiterplatten </td></tr><tr><td> Echo qualifiziert 384-Well Polypropylen Microplatte (384PP) </td><td> Labcyte </td><td> P-05.525 </td><td> Compound Quelle Mikrotiterplatten </td></tr><tr><td> 384-well Mikroplatten Polypropylen </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi Reagenzspender </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 Mikroplatten-Washer </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Automationszelle Waschen </td></tr><tr><td> Echo Liquid Handler </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo automatisierten Liquid-Handling-Plattform </td><td> Agilent Technologies </td><td> Standard-Modell </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetic Imaging Plate Reader </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Liste der Materialien und Reagenzien.

high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels

Bestimmte Mitglieder der Einwärtsgleichrichter Kalium (Kir) Kanal Familie drug targets für eine Vielzahl von Erkrankungen, einschließlich Bluthochdruck, Vorhofflimmern und Schmerzen 1,2 postuliert. Zum größten Teil jedoch Fortschritte zum Verständnis ihres therapeutischen Potenzials oder sogar grundlegenden physiologischen Funktionen durch den Mangel an guten pharmakologischen Werkzeugen verlangsamt. In der Tat hat die molekulare Pharmakologie des Einwärtsgleichrichter Familie weit hinter der des S4 Superfamilie der spannungsgesteuerten Kaliumkanäle (Kv)-Kanäle, für die eine Reihe von nanomolaren-Affinität und hochselektive Peptidtoxin Modulatoren 3 entdeckt haben zurückgeblieben. Die Bienengift Toxin tertiapin und seine Derivate sind potente Inhibitoren von Kir1.1 und Kir3 Kanäle 4,5, aber Peptide sind nur von begrenztem Nutzen therapeutisch als auch experimentell aufgrund ihrer antigenen Eigenschaften und schlechte Bioverfügbarkeit, metabolische Stabilität und Gewebe Penetranz. Die Entwicklung potenterund selektive niedermolekulare Sonden mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften werden ein Schlüsselfaktor für ein volles Verständnis der Physiologie und therapeutische Potenzial von Kir-Kanälen sein. Das Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) durch die National Institutes of Health (NIH) Common Fund hat Möglichkeiten geschaffen für akademische Wissenschaftler Sonde Entdeckung Kampagnen für molekulare Targets und Signalwege in der Notwendigkeit einer besseren pharmakologischen 6 einzuleiten. Die MLPCN bietet Forschern den Zugang zu Industrie-scale Screening-Zentren und die medizinische Chemie und Informatik zu unterstützen niedermolekularen Sonden, um die Funktion von Genen und Gen-Netzwerke aufzuklären entwickeln. Der entscheidende Schritt in der Zulassung zu dem MLPCN ist die Entwicklung eines robusten Target-oder Pathway-spezifischen Assay, zugänglich für High-Throughput-Screening (HTS) ist. Hier beschreiben wir, wie man eine Fluoreszenz-basierten Thallium (Tl +) flux assa entwickelny von Kir Kanalfunktion für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung 7,8,9,10. Der Assay basiert auf der Durchlässigkeit des K +-Kanals Pore der K + Kongener Tl + basiert. Eine handelsübliche Leuchtstofflampen Tl + Reporter-Farbstoff wird verwendet, um transmembrane Fluss der Tl + durch die Pore zu erkennen. Es gibt mindestens drei kommerziell erhältliche Farbstoffe, die sich für Tl + Flux Assays sind: BTC, FluoZin-2 und 7,8 Fluxor. Dieses Protokoll beschreibt Assay-Entwicklung mit FluoZin-2. Obwohl ursprünglich entwickelt und vermarktet als Zink-Indikator, Ausstellungen FluoZin-2 eine robuste und dosisabhängige Erhöhung der Fluoreszenzemission auf Tl + Bindung. Wir begann mit FluoZin-2 vor Fluxor verfügbar war 7,8 und haben weiterhin so 9,10 zu tun. Jedoch sind die Schritte in Assay-Entwicklung im wesentlichen identisch für alle drei Farbstoffe, und Benutzer sollten bestimmen, welche am besten geeigneten Farbstoff ist für ihre spezifische nEEDS. Wir diskutieren auch die Assays Performance-Benchmarks, die erreicht, um für die Einreise in die MLPCN in Betracht gezogen werden muss. Da Tl + gut durchzieht die meisten K +-Kanäle, sollte der Test sein, anpassbar an die meisten K +-Kanal Ziele.

Die Verwendung eines Tetracyclin-induzierbaren Expressionssystem bietet eine bequeme interne Kontrolle für die Unterscheidung Tl + Fluß durch endogene Wege und der Kir interessierenden Kanal. Abbildung 1 zeigt einige Beispiele von Zell Plattieren Karten in verschiedenen Arten von Experimenten verwendet. Die Positionen der Vertiefungen mit induzierten oder Tetracyclin-induzierten Zellen werden mit unterschiedlichen Farben dargestellt. Abbildung 2A zeigt die Source-Platte Kar...

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High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Verfahren zum Entwickeln und Validieren eines quantitativen Fluoreszenz-Assay zur Messung der Aktivität von Kalium Einwärtsgleichrichter (KIR) Kanäle für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung wird vorgestellt.

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

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