Name: high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות מענקי 1R21NS073097-01 ו1R01DK082884 (JSD) וקרן למכוני המענק PIER11VCTR הלאומי.

1. דור של שורות תאי polyclonal יציבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת קו איכות גבוהה יציב תא המבטא את ערוץ הקיר &#39;של ריבית היא צעד ראשון חשוב לקראת פיתוח assay הקרנת תפוקה גבוהה וחסון. המכונן K + overexpression הערוץ יכול להוביל הפעלה של מסלולים סלולריים ?...

<ol>
	<li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy.">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129 (2008).</li><li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K++channels:+recent+advances+and+future+possibilities.">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757 (2010).</li><li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels.">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213 (2007).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291 (1998).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin:+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286 (1999).</li><li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain:+a+Mount+Everest+in+the+making.">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764 (2010).</li><li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thallium-sensitive,+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells.">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671 (2004).</li><li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and.">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094 (2009).</li><li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1,+the+renal+outer+medullary+potassium+channel.">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42 (2011).</li><li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization,+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+(Kir)+channels+with+preference+for+Kir2.3,+Kir3.x,+and+Kir7.1.">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75 (2012).</li><li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213 (2008).</li></ol>

טיפול נתונים: לאחר שהנתונים נאסף, צעד נפוץ בניתוח כרוך בנרמול התגובה של כל גם פלואורסצנטי, F, לשווי הראשוני שלה בתחילת הניסוי, נ 0. זה נפוץ המכונה &quot;יחס סטטי&quot; וסמל &quot;F / F 0&quot;. במקרים בי F 0 נשלטים על ידי צבע חיווי פעולת יחס סטטי משמעותי...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> וקטור הביטוי טטרציקלין-מושרה </td></tr><tr><td> T-Rex-HEK293 תאים </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> שורת תאים טטרציקלין-מושרה </td></tr><tr><td> Lipofectamine מגיב LTX / פלוס </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> מגיב transfection </td></tr><tr><td> FBS </td><td> אטלנטה ביולוגית </td><td> S11550 </td><td> תקשורת סלולרית התרבות </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> תקשורת סלולרית התרבות </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> תקשורת סלולרית התרבות </td></tr><tr><td> S Blasticidin </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> תקשורת סלולרית התרבות </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> תקשורת סלולרית התרבות </td></tr><tr><td> HBSS-divalent חופשי </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> שטיפת תא </td></tr><tr><td> טריפסין-0.25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> התא דיסוציאציה </td></tr><tr><td> טטרציקלין-HCl </td><td> סיגמא </td><td> T9823 </td><td> מגיב אינדוקציה </td></tr><tr><td> FBS הדיאליזה </td><td> אטלנטה ביולוגית </td><td> S12650 </td><td> תקשורת ציפוי </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> צבע פלואורסצנטי </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> דאה טעינה </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> חיץ assay </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> חיץ assay </td></tr><tr><td> 3 NaHCO </td><td> סיגמא </td><td> S6297 </td><td> Tl + גירוי חיץ </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> סיגמא </td><td> M2643 </td><td> Tl + גירוי חיץ </td></tr><tr><td> קאסו 4 • 2H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> C3771 </td><td> Tl + גירוי חיץ </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G7528 </td><td> Tl + גירוי חיץ </td></tr><tr><td> תליום סולפט </td><td> אולדריץ </td><td> 204625 </td><td> Tl + גירוי חיץ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמא </td><td> H4034 </td><td> Tl + גירוי חיץ </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> סיגמא </td><td> D4540 </td><td> ממס </td></tr><tr><td> שמונה ערוץ האלקטרוני pipettor </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> ציפוי תא ב384 -גם צלחות </td></tr><tr><td> BD PureCoat צלחות אמינות מצופות 384 גם </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> microplates Assay </td></tr><tr><td> אקו כשיר 384 ובכן פוליפרופילן microplate (384PP) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> microplates המקור המתחם </td></tr><tr><td> microplates פוליפרופילן 384 גם </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> מתקן ריאגנט קומבי Multidrop </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 מכונת כביסת microplate </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> שטיפת תא אוטומטית </td></tr><tr><td> הד מטפל נוזלי </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte אקו 550 </td><td></td></tr><tr><td> פלטפורמת טיפול נוזל ראבו האוטומטי </td><td> טכנולוגיות Agilent </td><td> מודל סטנדרטי </td><td></td></tr><tr><td> חמאמה6000 טס FDSS </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> הדמית קינטי צלחת קורא </td></tr></tbody></table> טבלת 1. רשימה של חומרים וחומרים כימיים.

high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels

חברים מסוימים של המשפחה פנימה מיישר אשלגן (קיר &#39;) הערוץ הם הניחו מטרות תרופה למגוון של הפרעות, כולל יתר לחץ דם, פרפור פרוזדורים, ו1,2 כאב. ברוב המקרים, עם זאת, התקדמות לקראת הבנת הפוטנציאל הטיפולי שלהם או הפונקציות פיסיולוגיות בסיסיות אפילו הואטה על ידי המחסור בכלים פרמקולוגיים טובים. אכן, פרמקולוגיה המולקולרית של משפחת המיישר פנימה כבר פגרה הרחק מאחורי זו של superfamily S4 של אשלגן ערוצי מתח מגודר (KV), שעבורו מספר של זיקת nanomolar ומאפנני הרעלן פפטיד סלקטיבית מאוד התגלו 3. Tertiapin דבורת ארס הרעל ונגזרותיו הם מעכבי עצמה של Kir1.1 וKir3 ערוצים 4.5, אבל הפפטידים של שימוש המוגבל טיפולי, כמו גם בניסוי בשל מאפייני antigenic והזמינות הביולוגיות ירודה, יציבות מטבולית וחדירנות רקמות. הפיתוח של עצמהובדיקות, במולקולה קטנה סלקטיבית עם תכונות פרמקולוגיות משופרות תהיינה מפתח להבנת הפיסיולוגיה והפוטנציאל טיפולי של ערוצי קיר &#39;באופן מלא. מולקולרי ספריות בדיקות הפקת מרכז הרשת (MLPCN) הנתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) קרן משותפת יצרה הזדמנויות למדענים אקדמיים ליזום קמפייני בדיקת גילוי מטרות מולקולריות ולמסלולי איתות בצורך לפרמקולוגיה הטובה יותר 6. MLPCN מספק חוקרי גישה למרכז הקרנת התעשייה בקנה מידה ובכימיה ואינפורמטיקה רפואית תומכות לפתח חלליות מולקולה קטנה שתסברנה את הפונקציה של גנים ורשתות גנים. השלב הקריטי בהשגת הכניסה לMLPCN הוא הפיתוח של היעד או מסלול הספציפי assay החזק שהוא נוח לתפוקה גבוהה הקרנה (HTS). כאן, אנו מתארים כיצד לפתח פלואורסצנטי מבוסס תליום (Tl +) שטף אסאy של פונקצית קיר &#39;ערוץ להקרנת מתחם תפוקה גבוהה 7,8,9,10. assay מתבסס על החדירות של K + ערוץ הנקבובי לK + + Tl משלימתו. זמין מסחרי ניאון Tl + כתב צבע משמש לאיתור שטף הטרנסממברני של Tl + הדרך הנקבובית. ישנן לפחות שלושה צבעים זמינים מסחרי שמתאימים לTl + מבחני שטף: BTC, FluoZin-2, וFluxOR 7,8. פרוטוקול זה מתאר פיתוח assay באמצעות FluoZin-2. למרות שפותח במקור ושווק כמחוון אבץ, FluoZin-2 מוצגי גידול יציב ותלוי במינון בפליטת פלואורסצנטי על Tl + כריכה. התחלנו לעבוד עם FluoZin-2 לפני FluxOR היה זמין 7,8 וממשיך לעשות זאת 9,10. עם זאת, בשלבים בפיתוח assay הם למעשה זהים בכל השלושה הצבעים, והמשתמשים צריכים לקבוע איזה צבע מתאים ביותר עבור n הספציפי שלהםeeds. כמו כן, אנו דנים את מדדי ביצועים של assay שיש להגיע אליה כדי להיחשב לכניסה לMLPCN. מאז Tl + + בקלות מחלחל ערוצים רוב K, assay צריך להיות להתאמה מרבית היעדים + K הערוץ.

השימוש במערכת ביטוי טטרציקלין-מושרה מספק בקרה פנימית נוחה להבחנת Tl + שטף דרך מסלולים אנדוגניים וערוץ הקיר &#39;של עניין. איור 1 מציג מספר דוגמאות של מפות ציפוי סלולרי בשימוש בסוגים שונים של ניסויים. העמדות של בארות המכילות תאי uninduced או טטרציקלין מושרים מס...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels at JoVE.com

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

שיטות לפיתוח והאימות של assay פלואורסצנטי כמוני למדידת פעילותם של אשלגן rectifier פנימה (קיר &#39;) ערוצים להקרנת מתחם תפוקה גבוהה מוצגות.

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

שיטה של ​​permeabilization של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...