Name: high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento del National Institutes of concede Salute 1R21NS073097-01 e 1R01DK082884 (JSD) e Fondazione per il National Institutes concessione PIER11VCTR.

1. Generazione di linee cellulari stabili policlonali <ol><li> La creazione di una linea di cellule di alta qualità stabile che esprime il canale Kir di interesse è un primo passo importante verso lo sviluppo di una robusta high-throughput test di screening. Sovraespressione costitutiva K + canale può portare alla attivazione di vie di morte cellulare, stabile degenerazione linea cellulare e la perdita di prestazioni del dosaggio. Per evitare questi potenziali problemi e fornire un comodo controllo inter...

<ol>
	<li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy.">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129 (2008).</li><li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K++channels:+recent+advances+and+future+possibilities.">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757 (2010).</li><li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels.">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213 (2007).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291 (1998).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin:+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286 (1999).</li><li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain:+a+Mount+Everest+in+the+making.">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764 (2010).</li><li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thallium-sensitive,+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells.">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671 (2004).</li><li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and.">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094 (2009).</li><li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1,+the+renal+outer+medullary+potassium+channel.">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42 (2011).</li><li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization,+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+(Kir)+channels+with+preference+for+Kir2.3,+Kir3.x,+and+Kir7.1.">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75 (2012).</li><li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213 (2008).</li></ol>

Trattamento: Una volta che i dati sono raccolti, un passo comune consiste nell&#39;analisi normalizzare risposta di fluorescenza di ciascun pozzetto, F, al suo valore iniziale all&#39;inizio dell&#39;esperimento, F 0. Questo è comunemente indicato come &quot;rapporto statico&quot; e simboleggiato &quot;F / F 0&quot;. Nei casi in cui è dominato F 0 dal colorante indicatore dell&#39;operazione rapporto statico sarà sostanzialmente per correggere molti fattori...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Tetraciclina-inducibile vettore di espressione </td></tr><tr><td> T-REX-cellule HEK293 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Tetraciclina-inducibile linea cellulare </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / Plus Reagent </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Transfection reagente </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Cella cultura dei media </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Cella cultura dei media </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Cella cultura dei media </td></tr><tr><td> Blasticidina S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Cella cultura dei media </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Cella cultura dei media </td></tr><tr><td> HBSS-bivalente libero </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Cella di lavaggio </td></tr><tr><td> Tripsina 0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Dissociazione cellulare </td></tr><tr><td> Tetraciclina-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Induzione reagente </td></tr><tr><td> Dializzato FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Placcatura dei media </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Colorante fluorescente </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Dye carico </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Assay Buffer </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Assay Buffer </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + stimolo tampone </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + stimolo tampone </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + stimolo tampone </td></tr><tr><td> D-Glucosio </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + stimolo tampone </td></tr><tr><td> Solfato di tallio </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + stimolo tampone </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + stimolo tampone </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Otto-canale elettronico pipetta </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Placcatura cella in 384 -pozzetti </td></tr><tr><td> BD PureCoat ammina rivestite piastre a 384 pozzetti </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Dosaggio micropiastre </td></tr><tr><td> Echo qualificato 384-Well polipropilene micropiastre (384PP) </td><td> Labcyte </td><td> P-05.525 </td><td> Composti di origine micropiastre </td></tr><tr><td> 384 pozzetti in polipropilene micropiastre </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi reagente dispenser </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 Lavatore </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Cella di lavaggio automatico </td></tr><tr><td> Echo liquid handler </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo piattaforma automatizzata di gestione dei liquidi </td><td> Agilent Technologies </td><td> Modello di serie </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetic immagini lettore di piastre </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Elenco dei materiali e reagenti.

high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels

Membri specifici della famiglia verso l&#39;interno canale del potassio raddrizzatore (Kir) sono postulato bersagli farmacologici per una varietà di disturbi, tra cui l&#39;ipertensione, fibrillazione atriale, e 1,2 dolore. Per la maggior parte, tuttavia, i progressi verso la comprensione il loro potenziale terapeutico o funzioni fisiologiche anche di base è stata rallentata dalla mancanza di buoni strumenti farmacologici. In effetti, la farmacologia molecolare della famiglia raddrizzatore verso l&#39;interno è rimasta molto indietro quella della superfamiglia S4 del potassio voltaggio-dipendenti (Kv) canali, per i quali un certo numero di nanomolare affinità e altamente modulatori selettivi tossine peptidi sono stati scoperti 3. Il tertiapin veleno d&#39;api tossina e suoi derivati ​​sono potenti inibitori del Kir1.1 e Kir3 canali 4,5, ma peptidi sono di uso limitato terapeuticamente nonché sperimentalmente a causa delle loro proprietà antigeniche e scarsa biodisponibilità, stabilità metabolica e penetranza tessuto. Lo sviluppo di potentie selettivi piccole molecole sonde con migliori proprietà farmacologiche sarà una chiave per comprendere appieno la fisiologia e la potenziale terapeutico dei canali Kir. La molecolare Biblioteche Sonde Produzione Centro connessioni di rete (MLPCN) supportato dal National Institutes of Health (NIH) Fondo comune ha creato opportunità per gli scienziati accademici di avviare campagne di sonda di rilevamento per target molecolari e vie di segnalazione che hanno bisogno di una migliore farmacologia 6. Il MLPCN fornisce ai ricercatori l&#39;accesso per l&#39;industria scala centri di screening e chimica farmaceutica e informatica sostegno per sviluppare piccole molecole sonde di chiarire la funzione dei geni e delle reti di geni. La fase critica l&#39;ammissione al MLPCN è lo sviluppo di un saggio robusto bersaglio o percorso specifico che è suscettibile di screening ad alto rendimento (HTS). Qui, descriviamo come sviluppare una fluorescenza a base di tallio (Tl +) flusso assay della funzione Kir canale per screening ad alto rendimento composto 7,8,9,10. Il saggio è basato sulla permeabilità del poro K + canale al K + congenere Tl +. A disponibile in commercio fluorescente Tl + colorante reporter viene utilizzato per rilevare il flusso transmembrana di Tl + attraverso il poro. Ci sono almeno tre coloranti disponibili in commercio che sono adatti per TL + saggi flusso: BTC, FluoZin-2, 7,8 e FluxOR. Questo protocollo descrive lo sviluppo dosaggio con FluoZin-2. Anche se originariamente sviluppati e commercializzati come un indicatore di zinco, FluoZin-2 presenta un incremento robusto e dose-dipendente in emissione di fluorescenza su Tl + vincolante. Abbiamo iniziato a lavorare con FluoZin-2 prima FluxOR era disponibile 7,8 e hanno continuato a farlo 9,10. Tuttavia, le fasi di sviluppo del test sono sostanzialmente identiche per tutti e tre i coloranti, e gli utenti devono determinare quale colorante è più adatto per la loro specifica nresponsabili politici. Discutiamo anche benchmark delle prestazioni del saggio che devono essere raggiunti da considerare per l&#39;ingresso al MLPCN. Poiché Tl + permea facilmente la maggior parte dei canali del K +, il test deve essere adattabile alla maggior parte dei canali K + obiettivi.

L&#39;uso di una tetraciclina inducibile sistema di espressione fornisce un comodo controllo interno per distinguere Tl + flusso attraverso percorsi endogeni e il canale Kir di interesse. Figura 1 mostra alcuni esempi di mappe di placcatura cellulari utilizzate in diversi tipi di esperimenti. Le posizioni dei pozzetti contenenti cellule uninduced o tetraciclina indotta sono indicati con colori diversi. Figura 2A mostra la mappa piastra sorgente utilizzato per determinare la c...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels at JoVE.com

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Metodi per lo sviluppo e la convalida di un metodo quantitativo di fluorescenza per misurare l&#39;attività di potassio raddrizzatore attivo (Kir) canali di screening ad alto rendimento composto è presentato.

High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Screen piccole molecole

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Ricerca

Biologia

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Throughput Screening elevati di attività Endoglucanase fungine in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Un test di screening a fluorescenza per l&#39;identificazione di modulatori Canali GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Un metodo di Permeabilization di<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli embrioni per saggi di piccole molecole di attività

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Un manuale Schermo piccole molecole si avvicina ad alta velocità Uso embrioni di zebrafish

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...