Name: high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00
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この作品は、国立保健研究所（NIH）の助成金の1R21NS073097-01と1R01DK082884（JSD）と国立衛生研究所の助成金PIER11VCTRための財団からの資金によって支えられている。

1。安定したポリクローナル細胞株の作製<ol><li>興味のあるキールチャネルを発現している高品質の安定した細胞株の確立は、堅牢なハイスループットスクリーニングアッセイの開発に向けた重要な第一歩である。構成性K +チャネルの過剰発現は細胞死の経路、安定細胞株の変性とアッセイ性能の損失の活性化につながることができます。 （下記参照）は、これらの潜在的な問題を?...

<ol>
	<li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy.">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129 (2008).</li><li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K++channels:+recent+advances+and+future+possibilities.">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757 (2010).</li><li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels.">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213 (2007).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291 (1998).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin:+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286 (1999).</li><li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain:+a+Mount+Everest+in+the+making.">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764 (2010).</li><li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thallium-sensitive,+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells.">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671 (2004).</li><li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and.">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094 (2009).</li><li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1,+the+renal+outer+medullary+potassium+channel.">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42 (2011).</li><li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization,+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+(Kir)+channels+with+preference+for+Kir2.3,+Kir3.x,+and+Kir7.1.">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75 (2012).</li><li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213 (2008).</li></ol>

データ処理：いったんデータが収集され、分析の一般的なステップは、実験の最初にF 0を初期値に各ウェルの蛍光応答、Fを、正規化が含まれます。これは、一般的に&quot;静的比&quot;と呼ばれ、 &quot;F / F 0&quot;に象徴される。F0を指示薬色素によって支配されている例では静的比率演算が実質的に、このような照明、信号コレクション内disuniformities...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td>インビトロジェン</td><td> V1033-20 </td><td>テトラサイクリン誘導発現ベクター</td></tr><tr><td> T-REX-HEK293細胞</td><td>インビトロジェン</td><td> R71007 </td><td>テトラサイクリン誘導性細胞株</td></tr><tr><td>リポフェクタミンLTX /プラス試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> 15338100 </td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTAバイオ</td><td> S11550 </td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11965 </td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB </td><td>インビトロジェン</td><td> 10687-010 </td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ブラストサイジンS </td><td>インビトロジェン</td&gt; <td> R210-01 </td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140 </td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>フリーHBSS - 二価</td><td>メディアテック</td><td> 21022CV </td><td>細胞洗浄</td></tr><tr><td>トリプシン0.25パーセント</td><td>メディアテック</td><td> 25053CI </td><td>細胞解離</td></tr><tr><td>テトラサイクリン塩酸</td><td>シグマ</td><td> T9823 </td><td>誘導試薬</td></tr><tr><td>透析FBS </td><td> ATLANTAバイオ</td><td> S12650 </td><td>プレート培地</td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td>インビトロジェン</td><td> F24189 </td><td>蛍光染料</td></tr><tr><td>プルロニックF-127 </td><td>インビトロジェン</td><td> P-3000MP </td><td>色素ローディング</td></tr><tr><td> HBSS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14175 </td><td>アッセイバッファー</td></tr><tr><td> HEPES </td><td>インビトロジェン</td><td> 15630 </td><td>アッセイバッファー</td></tr><tr><td> NaHCO 3を </td><td>シグマ</td><td> S6297 </td><td> TL +刺激バッファー</td></tr><tr><td> MgSO 4を </td><td>シグマ</td><td> M2643 </td><td> TL +刺激バッファー</td></tr><tr><td> •のCaSO 4·2H 2 O </td><td>シグマ</td><td> C3771 </td><td> TL +刺激バッファー</td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td>シグマ</td><td> G7528 </td><td> TL +刺激バッファー</td></tr><tr><td>硫酸タリウム</td><td>アルドリッチ</td><td> 204625 </td><td> TL +刺激バッファー</td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H4034 </td><td> TL +刺激バッファー</td></tr><tr><td> DMSO </td><td>シグマ</td><td> D4540 </td><td>溶剤</td></tr><tr><td> 8チャネルの電子ピペッター</td><td>バイオヒット</td><td> E300 </td><td> 384内のセルメッキ -ウェルプレート</td></tr><tr><td> BD PureCoatアミンコーティングした384ウェルプレート</td><td> BD Biosciences社</td><td> 356719 </td><td>アッセイマイクロプレート</td></tr><tr><td>エコーは、384ウェルマイクロプレートポリプロピレン（384PP）を認定</td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td>化合物源マイクロプレート</td></tr><tr><td> 384ウェルマイクロプレートポリプロピレン</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td>マルチドロップコンビ試薬ディスペンサー</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405マイクロプレートウォッシャー</td><td> BioTekの</td><td> ELx405HT </td><td>自動細胞洗浄</td></tr><tr><td>液体ハンドラをエコー</td><td> Labcyte </td><td> Labcyteエコー550 </td><td></td></tr><tr><td>ブラボー自動リキッドハンドリングプラットフォーム</td><td>アジレント·テクノロジー</td><td>標準モデル</td><td></td></tr><tr><td> Hamama津FDSS 6000 </td><td>浜松市</td><td></td><td>キネティック·イメージングプレートリーダー</td></tr></tbody></table> 表1。材料および試薬のリスト。

high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels

内向き整流カリウム（KIR）チャネルファミリーの特定のメンバーは、高血圧、心房細動、疼痛1,2を含む様々な疾患のために創薬ターゲットを想定しています。しかし、ほとんどの場合、それらの治療法としての可能性、あるいは基本的な生理機能を理解するための進捗状況は良い薬理学的ツールの不足により減速されています。確かに、内向き整流ファミリーの分子薬理学は、ナノモル親和性のための番号電位依存性カリウム（KV）チャネルのS4スーパーファミリーのそれより大幅に遅れていると選択性の高いペプチド毒素変調器は3が発見されました。ハチ毒毒素tertiapin及びその誘導体は、Kir1.1とKir3チャネル4,5の強力な阻害剤であるが、ペプチドは実験だけでなく、治療的に使用が制限され、その抗原特性と貧しい生物学的利用能、代謝安定性、組織浸透度に起因しています。強力の開発改良された薬理学的特性を有する選択的低分子プローブは、完全にキールチャネルの生理機能と治療の可能性を理解するための鍵となるでしょう。 学術、科学者がより良い薬理6必要としている分子標的とするシグナル伝達経路のためのプローブディスカバリキャンペーンを開始するために、米国立衛生研究所によってサポートされて分子ライブラリプローブプロダクションセンターネットワーク（MLPCN）は、衛生研究所（NIH）の共通基金の機会を作成しています。 MLPCNは、業界規模スクリーニングセンターや医薬品化学研究者にアクセスを提供し、インフォマティクス、遺伝子や遺伝子ネットワークの機能を解明する小分子プローブを開発するためにサポートしています。 MLPCNにエントリを得るための重要なステップは、ハイスループットスクリーニング（HTS）に適している堅牢なターゲットまたは経路特異的アッセイの開発である。 ここでは、蛍光ベースのタリウム（Tl +）フラックスASSAを開発する方法について説明しハイスループット化合物スクリーニングのための7,8,9,10キールチャネル機能のy。アッセイは、Kの透過性K +同族TLにチャンネル孔+に基づいています。市販の蛍光TL +レポーター色素が細孔を通過Tlの貫通フラックス+を検出するために使用されます。 BTC、FluoZin-2、7,8 FluxOR：TL +フラックスアッセイに適している少なくとも3市販の染料があります。このプロトコルはFluoZin-2を用いたアッセイの開発について説明します。もともと亜鉛指標として開発·販売していますが、FluoZin-2展示Tlの時に蛍光発光+結合で堅牢かつ用量依存的に増加。 FluxORは7,8使用可能だったので9,10を行うために続けている前に、我々はFluoZin-2で働き始めた。しかし、彼らの特定のnに最も適した染料アッセイ開発の手順は、すべての3つの色素について本質的に同一であるため、ユーザーは判断する必要がありますeeds。またMLPCNへのエントリーのために考慮されることで合意されている必要がありアッセイの性能ベンチマークを議論する。 TL +は容易にほとんどのK +チャネルに浸透しているので、このアッセイは、ほとんどのK +チャネルターゲットに適応する必要があります。

テトラサイクリン誘導発現系の使用が特徴的な内因性経路を介してTL +フラックスと関心のあるキールチャネルのための便利な内部統制を提供しています。 図1は、実験の種類で使用されるセルメッキマップの例をいくつか示します。非誘導またはテトラサイクリン誘導細胞を含むウェルの位置が異なる色で示されています。 図2Aは、アッセイ開発と化合物ス?...

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High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

内向き整流カリウム（KIR）ハイスループット化合物スクリーニングのためのチャネルの活性を測定するための定量的な蛍光アッセイを開発し、検証するための方法が提示されます。

内向き整流カリウムチャネルの小分子モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

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大規模ゼブラフィッシュベース in vivoで小分子スクリーン

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

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蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

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における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

GIRKチャネルのモジュレーターを同定するための蛍光スクリーニングアッセイ

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

の透過方法<em&gt;ショウジョウバエ</em小分子の活性のアッセイのための&gt;胚

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚を用いた高スループットへのアプローチマニュアル小分子スクリーン

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...