Name: high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00
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이 작품은 건강 보조금 1R21NS073097-01과 1R01DK082884 (JSD)과 국립 연구소 부여 PIER11VCTR에 대한 재단의 국립 연구소에서 자금에 의해 지원되었다.

1. 안정적인 Polyclonal 세포 라인의 생성 <ol><li> 관심 Kir 채널을 표현하는 고품질의 안정적인 세포 라인의 설립은 강력한 높은 처리량 검사 분석을 개발 대한 중요한 첫 걸음입니다. 제정 K + 채널 overexpression은 셀 사망 경로, 안정적인 세포 라인 변성 및 분석 성능의 손실의 활성화로 이어질 수 있습니다. 이러한 잠재적 인 문제를 방지하고 분석 개발을위한 편리한 내부 통제 (아래 참조)를 ?...

<ol>
	<li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy.">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129 (2008).</li><li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K++channels:+recent+advances+and+future+possibilities.">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757 (2010).</li><li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels.">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213 (2007).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291 (1998).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin:+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286 (1999).</li><li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain:+a+Mount+Everest+in+the+making.">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764 (2010).</li><li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thallium-sensitive,+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells.">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671 (2004).</li><li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and.">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094 (2009).</li><li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1,+the+renal+outer+medullary+potassium+channel.">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42 (2011).</li><li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization,+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+(Kir)+channels+with+preference+for+Kir2.3,+Kir3.x,+and+Kir7.1.">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75 (2012).</li><li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213 (2008).</li></ol>

데이터 치료 : 일단 데이터가 분석에 일반적인 단계는 실험, F 0 초에 초기 값으로 각도의 형광 반응, F를 정규화, 포함한다 수집하고 있습니다. 이것은 일반적으로 &quot;정적 비율&quot;로 지칭하고 &quot;F / F 0&quot;상징합니다. F 0 표시기 염료에 의해 ​​지배되는 경우에는 정적 비율 작업이 실질적으로 같은 조명, 신호 컬렉션에 disuniformities 등 여러 요인...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> 테트라 사이클린-inducible 표현 벡터 </td></tr><tr><td> T-렉스 - HEK293 세포 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> 테트라 사이클린-inducible 세포 라인 </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / 플러스 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Transfection 시약 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11550 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11,965 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15,140 </td><td> 세포 배양 미디어 </td></tr><tr><td> 무료 HBSS - 이가의 </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> 셀 세척 </td></tr><tr><td> 트립신 - 0.25 % </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> 세포 분리 </td></tr><tr><td> 테트라 사이클린-HCL </td><td> 시그마 </td><td> T9823 </td><td> 유도 시약 </td></tr><tr><td> Dialyzed FBS </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S12650 </td><td> 도금 미디어 </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> 형광 염료 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> 염료로드 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14,175 </td><td> 검정 버퍼 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15,630 </td><td> 검정 버퍼 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 시그마 </td><td> S6297 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 시그마 </td><td> M2643 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> 카소 4 • 2H 2 O </td><td> 시그마 </td><td> C3771 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> D-포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G7528 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> 탈륨 황산 </td><td> 올드리치 </td><td> 204625 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H4034 </td><td> TL + 자극 버퍼 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 시그마 </td><td> D4540 </td><td> 용제 </td></tr><tr><td> 여덟 채널 전자 pipettor </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> 384에서 셀 도금 -잘 접시 </td></tr><tr><td> BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시 </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> 검정 microplates </td></tr><tr><td> 에코는 384 자 폴리 프로필렌 microplate (384PP)를 자격 </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> 합성 소스 microplates </td></tr><tr><td> 384도 폴리 프로필렌 microplates </td><td> Greiner 바이오 하나 </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop 콤비 시약 디스펜서 </td><td> 열 과학 </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 microplate 와셔 </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> 자동 셀 세척 </td></tr><tr><td> 액체 처리기를 반향 </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte 에코 550 </td><td></td></tr><tr><td> 브라보, 자동화 된 액체 처리 플랫폼 </td><td> 애질런트 테크놀로지스 </td><td> 표준 모델 </td><td></td></tr><tr><td> Hamama츠 FDSS 6000 </td><td> 하마 마츠 </td><td></td><td> 운동 이미징 플레이트 판독기 </td></tr></tbody></table> 표 1. 재료 및 시약의 목록입니다.

high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels

안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 채널 가족의 특정 구성원은 고혈압, 심방 세동과 통증 1,2 등의 질환의 다양한에 대한 약물 목표를 postulated 있습니다. 대부분의 경우, 그러나, 자신의 치료 가능성이나 기본적인 생리 기능을 이해하는 방향으로 진행 좋은 약리 도구의 부족에 의해 느려졌습니다. 사실, 안쪽 정류기 제품군의 분자 약리학 훨씬 nanomolar 화성과 매우 선택적 펩타이드 독소의 변조기의 번호가 3 발견되었습니다 된 전압 개폐 칼륨 (KV) 채널의 S4 superfamily의 뒤에 느껴지있다. 벌 독이 독소의 tertiapin 및 파생 4,5 Kir1.1와 Kir3 채널의 강력한 억제제하지만, 펩티드는 실험적으로 therapeutically뿐만 아니라 제한된 용도의 antigenic 속성과 가난한 생체 이용률, 신진 대사 안정성과 조직 penetrance로 인해 수 있습니다. 강력한 개발향상된 약리 특성을 가진 선택적 작은 분자 프로브는 완전히 생리학과 Kir 채널 치료 가능성을 이해하는 열쇠가 될 것이다. 학술 과학자들은 더 나은 약리학 6 필요로하는 분자 표적 및 신호 전달 경로에 대한 프로브 발견 캠페인을 시작하기 위해 국립 보건원에서 지원하는 분자 도서관 프로브 제작 센터 네트워크 (MLPCN (주) NIH) 공통 기금은 기회를 만들었습니다. MLPCN는 연구자에게 산업 규모 검진 센터, 의약 화학, 정보학은 유전자와 유전자 네트워크의 기능을 명료하게하다하는 작은 분자 프로브를 개발 지원에 대한 액세스를 제공합니다. MLPCN에 항목을 얻을의 중요한 단계는 높은 처리량 검사 (HTS)에 대한 의무입니다 강력한 대상 또는 경로 별 분석의 개발입니다. 여기, 우리는 형광 기반의 탈륨 (TL +) 자속 assa을 개발하는 방법에 대해 설명합니다높은 처리량 화합물 심사 7,8,9,10에 대한 Kir 채널 기능의 y는. 분석은 K의 투자율 + K + congener TL +에 채널 기공을 기반으로합니다. 상업적으로 이용 가능한 형광 TL + 기자 염료가 모공을 통해 TL의 transmembrane 유량을 + 감지하는 데 사용됩니다. BTC, FluoZin-2 및 FluxOR 7,8 : TL + 자속 assays에 적합 적어도 세 상업적으로 이용 가능한 염료가 있습니다. 이 프로토콜은 FluoZin-2를 사용하여 분석 개발에 대해 설명합니다. 원래 개발 및 아연 표시로 판매했지만, FluoZin-2 전시 TL시 형광 방출 + 바인딩에 강력하고 복용 종속적 인 증가합니다. 우리는 FluxOR는 7,8 사용할 수 등 9,10 할 계속하기 전에 FluoZin-2와 협력하기 시작했습니다. 그러나, 분석 개발 단계는 세 염료에 본질적으로 동일하며, 사용자는 자신의 특정 N에 가장 적합한 어떤 염료 확인해야합니다eeds. 우리는 또한 MLPCN에 항목으로 간주 할 수에 도달해야합니다 검정의 성능 벤치 마크에 대해 설명합니다. TL +는 쉽게 대부분의 K + 채널을 permeates 때문에, 분석은 대부분의 K + 채널 대상에 적용해야합니다.

테트라 사이클린-inducible 표현 시스템의 사용은 내생 경로와 관심 Kir 채널을 통해 TL + 자속을 구별하기에 편리한 내부 통제를 제공합니다. 그림 1 쇼 실험의 다른 유형에 사용되는 셀 도금지도의 예. uninduced 또는 테트라 사이클린 - 유도 세포를 포함하는 우물의 위치는 서로 다른 색상으로 표시됩니다. 그림 2A는 분석 개발과 화합물 심사에 대한 최적의 TL + ...

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High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 높은 처리량 화합물 심사에 대한 채널의 활동을 측정하기위한 양적 형광 분석을 개발하고 검증하기위한 방법이 제공됩니다.

안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

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대규모 Zebrafish 기반 생체내에서 작은 분자 화면

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

연구

생물학

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

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형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

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에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

GIRK 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석

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High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

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의 Permeabilization의 방법<em&gt; 초파리</em작은 분자 활동의 분석 실험을위한&gt; 태아

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish의 배아를 사용하여 높은 처리량 접근 수동 작은 분자 화면

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...