Name: high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Institutes of Health tilskudd 1R21NS073097-01 og 1R01DK082884 (JSD) og Stiftelsen for National Institutes tilskuddet PIER11VCTR.

1. Generasjon Stabile Polyklonale Cell Lines <ol><li> Etableringen av en høy kvalitet stabil cellelinje som uttrykker Kir-kanalen i området er et viktig første skritt mot å utvikle en robust high-throughput screening-analysen. Konstituerende K + kanalen overexpression kan føre til aktivering av celledød, stabil cellelinje degenerasjon og tap av analyseytelsen. Å unngå disse potensielle problemer og gir en praktisk internkontroll for analysen utvikling (se nedenfor), er et tetracyklin-induserbare eks...

<ol>
	<li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy.">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129 (2008).</li><li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K++channels:+recent+advances+and+future+possibilities.">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757 (2010).</li><li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels.">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213 (2007).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291 (1998).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin:+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286 (1999).</li><li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain:+a+Mount+Everest+in+the+making.">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764 (2010).</li><li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thallium-sensitive,+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells.">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671 (2004).</li><li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and.">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094 (2009).</li><li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1,+the+renal+outer+medullary+potassium+channel.">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42 (2011).</li><li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization,+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+(Kir)+channels+with+preference+for+Kir2.3,+Kir3.x,+and+Kir7.1.">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75 (2012).</li><li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213 (2008).</li></ol>

Data behandling: Etter at data blir samlet inn, innebærer en vanlig trinn i analysen normalisere hver brønnens fluorescens respons, F, til sin opprinnelige verdi ved begynnelsen av eksperimentet, 0 F. Dette er ofte referert til som &quot;statiske ratio&quot; og symbolisert &quot;F / F 0&quot;. I tilfeller der F 0 er dominert av indikatoren fargestoff den statiske ratio operasjonen vil vesentlig korrigere for mange faktorer som disuniformities i belysning, si...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Tetracyklin-induserbar ekspresjonsvektor </td></tr><tr><td> T-Rex-HEK293 celler </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Tetracyklin-induserbar cellelinje </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / Plus Reagent </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Transfeksjon reagens </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Cellekulturmedier </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Cellekulturmedier </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Cellekulturmedier </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Cellekulturmedier </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Cellekulturmedier </td></tr><tr><td> HBSS-toverdig gratis </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Cell vask </td></tr><tr><td> Trypsin-0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Cell dissosiasjon </td></tr><tr><td> Tetracyklin-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Induksjon reagens </td></tr><tr><td> Dialyserte FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Plating media </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Fluorescerende fargestoff </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Dye lasting </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Analysebuffer </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Analysebuffer </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + stimulus buffer </td></tr><tr><td> MgSo4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + stimulus buffer </td></tr><tr><td> Caso 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + stimulus buffer </td></tr><tr><td> D-glukose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + stimulus buffer </td></tr><tr><td> Thallium sulfate </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + stimulus buffer </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + stimulus buffer </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Løsemiddel </td></tr><tr><td> Åttekanalsutgang elektronisk pipette </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Cell plating i 384 -brønners plater </td></tr><tr><td> BD PureCoat amin-belagte 384-brønners plater </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Analyseresultatene mikroplater </td></tr><tr><td> Echo kvalifisert 384-Well polypropylen mikroplate (384PP) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> Sammensatte kilde mikroplater </td></tr><tr><td> 384-brønnen polypropylen mikroplater </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi reagensdispenseren </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 mikrotiterplatevasker </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Automatisert celle vask </td></tr><tr><td> Ekko flytende handler </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo automatiserte væskehåndtering plattform </td><td> Agilent Technologies </td><td> Standard modellen </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetic bildebehandling plateavleser </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Liste over materialer og reagenser.

high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels

Bestemte medlemmer av den innovervendte likeretter kalium (KIR) kanal familie er postulert stoffet mål for en rekke lidelser, inkludert hypertensjon, atrieflimmer, og smerte 1,2. For det meste har imidlertid fremgang mot å forstå deres terapeutiske potensialet eller selv grunnleggende fysiologiske funksjoner blitt bremset av mangel på gode farmakologiske verktøy. Faktisk har den molekylære farmakologien innover likeretter familien ligget langt bak at av S4 superfamily av spenningsstyrte kaliumkanaler (Kv) kanaler, som en rekke nanomolar affinitet og svært selektive peptid toksin modulatorer har blitt oppdaget tre. Bee venom toxin tertiapin og dets derivater er potente inhibitorer av Kir1.1 og Kir3 kanaler 4,5, men peptider er av begrenset bruk terapeutisk samt eksperimentelt grunnet deres antigene egenskaper og dårlig biotilgjengelighet, metabolsk stabilitet og vev penetrans. Utviklingen av potenteog selektive små-molekyl sonder med forbedrede farmakologiske egenskaper vil være en nøkkel til fullt ut å forstå fysiologi og terapeutiske potensialet i Kir-kanaler. Molecular Libraries Sonder produksjon sentrum Network (MLPCN) støttet av National Institutes of Health (NIH) felles fond har skapt muligheter for faglig forskere å starte probe discovery kampanjer for molekylære mål og signalveier som har behov for bedre farmakologi 6. Den MLPCN gir forskerne tilgang til industri-skala screening sentre og medisinsk kjemi og informatikk støtte for å utvikle små-molekyl sonder for å belyse genenes funksjoner og gen nettverk. Det kritiske i å få adgang til MLPCN er utviklingen av en robust mål-eller sti-spesifikk metode som er mottagelig for high-throughput screening (HTS). Her beskriver vi hvordan du kan utvikle en fluorescens-basert thallium (Tl +) flux assay av Kir kanalfunksjon for high-throughput screening sammensatte 7,8,9,10. Forsøket er basert på permeabiliteten av K + kanal pore til K + kongenerprofil Tl +. En kommersielt tilgjengelig fluorescerende Tl + reporter fargestoff brukes til å oppdage transmembrane fluks av Tl + gjennom pore. Det er minst tre kommersielt tilgjengelige fargestoffer som er egnet for Tl + flux analyser: BTC, FluoZin-2, og FluxOR 7,8. Denne protokollen beskriver analysen utvikling ved hjelp FluoZin-2. Selv opprinnelig utviklet og markedsført som en sink indikator, FluoZin-2 viser en robust og doseavhengig økning i fluorescensemisjon på Tl + binding. Vi begynte å jobbe med FluoZin-2 før FluxOR var tilgjengelig 7,8 og har fortsatt å gjøre det 9,10. Men trinnene i analysen utvikling er i hovedsak identisk for alle tre fargestoffer, og brukerne bør avgjøre hvilken farge er mest hensiktsmessig for deres spesifikke needs. Vi diskuterer også analysen er ytelsestester som må nås for å bli vurdert for innreise til MLPCN. Siden Tl + lett gjennomtrenger fleste K +-kanaler, bør analysen kunne tilpasses de fleste K + kanal mål.

Bruken av en tetracyklin-induserbare ekspresjonssystem gir en praktisk internkontroll for skille Tl + fluks gjennom endogene trasé og Kir kanal av interesse. Figur 1 viser noen eksempler på celle plating kartene som brukes i forskjellige typer av eksperimenter. Posisjonene til brønner inneholdende uninduced eller tetracyklin-indusert celler er angitt med forskjellige farger. Figur 2A viser kilden plate kart brukes til å bestemme den optimale Tl + konsentrasjon ...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels at JoVE.com

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Metoder for å utvikle og validere en kvantitativ fluorescens analysen for å måle aktiviteten til indre likeretter kalium (Kir) kanaler for high-throughput sammensatte screening er presentert.

High-throughput screening for små-molekyl modulatorer av Inderlige likeretter kaliumkanaler

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

En fluoriserende Screening Assay for å identifisere modulatorer av GIRK kanaler

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Høy gjennomstrømming Funksjonell Screening ved hjelp av en hjemmelaget Dual-glød Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

En Måte Permeabilization av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo for Analyser av Small Molecule aktivitet

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

En manuell Small Molecule Screen Nærmer Høy throughput Bruke Sebrafisk embryo

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Høy gjennomstrømming Screening for kjemi modulatorer av Post-transcriptionally Regulerte Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identifisering av kinase-substrat Pairs Bruke Høy throughput screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...