Name: high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00
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Este trabalho foi suportado por financiamento do Instituto Nacional de Saúde concede 1R21NS073097-01 e 1R01DK082884 (JSD) e Fundação para o National Institutes concessão PIER11VCTR.

1. A geração de linhas celulares estáveis ​​policlonais <ol><li> O estabelecimento de uma linha de células de alta qualidade estável expressando o canal Kir de interesse é um primeiro passo importante para o desenvolvimento de um ensaio de rastreio de alto rendimento robusto. Constitutivo K + superexpressão do canal pode conduzir a activação de vias de morte celular, degeneração linha estável de células e perda de desempenho do ensaio. Para evitar estes problemas potenciais e proporcionar u...

<ol>
	<li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy.">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129 (2008).</li><li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K++channels:+recent+advances+and+future+possibilities.">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757 (2010).</li><li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels.">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213 (2007).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291 (1998).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin:+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286 (1999).</li><li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain:+a+Mount+Everest+in+the+making.">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764 (2010).</li><li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thallium-sensitive,+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells.">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671 (2004).</li><li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and.">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094 (2009).</li><li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1,+the+renal+outer+medullary+potassium+channel.">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42 (2011).</li><li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization,+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+(Kir)+channels+with+preference+for+Kir2.3,+Kir3.x,+and+Kir7.1.">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75 (2012).</li><li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213 (2008).</li></ol>

Tratamento de dados: Uma vez que os dados são recolhidos, um passo comum na análise envolve a normalizar resposta da fluorescência de cada poço, F, ao seu valor inicial no início da experiência, F 0. Isto é vulgarmente referido como o &quot;índice estático&quot; e simbolizado &quot;F / F 0&quot;. Nos casos em que F 0 é dominado pelo corante indicador de operação estática proporção substancialmente corrigir por muitos factores tais como desunifor...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Tetraciclina-vector de expressão indutível </td></tr><tr><td> T-rex-células HEK293 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Tetraciclina induzível por linha celular </td></tr><tr><td> Lipofectamine Reagente LTX / Plus </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Reagente de transfecção </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> Blasticidina S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Meios de cultura de células </td></tr><tr><td> HBSS-bivalente livre </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Lavagem de células </td></tr><tr><td> Tripsina 0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Dissociação celular </td></tr><tr><td> Tetraciclina-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Reagente indução </td></tr><tr><td> FBS dialisado </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Meios seletivos </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Corante fluorescente </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Corante de carga </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Tampão de ensaio </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Tampão de ensaio </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> Sulfato de tálio </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + estímulo tampão </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Oito canais pipetador eletrônico </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Chapeamento de celular em 384 -placas de poços </td></tr><tr><td> BD PureCoat amina revestidos 384 poços </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Microplacas de ensaio </td></tr><tr><td> Eco qualificados 384-Bem polipropileno microplaca (384PP) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> Fonte microplacas compostos </td></tr><tr><td> 384-poços de microplacas de polipropileno </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Dispensador de reagente Multidrop Combi </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 lavadora </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Lavagem de células automatizado </td></tr><tr><td> Echo manipulador líquido </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Eco 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo plataforma automatizado de manuseamento de líquidos </td><td> Agilent Technologies </td><td> Modelo padrão </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu 6000 FDSS </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Cinética de imagem placa leitor </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Lista de materiais e reagentes.

high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels

Membros específicos da família retificador de potássio para o interior do canal (Kir) são postuladas alvos terapêuticos para uma variedade de doenças, incluindo a hipertensão, a fibrilação atrial, e de 1,2 a dor. Para a maior parte, no entanto, os avanços na compreensão do seu potencial terapêutico, ou mesmo funções fisiológicas básicas foi retardado pela falta de boas ferramentas farmacológicas. Na verdade, a farmacologia molecular da família rectificador de entrada tem ficado muito aquém do da superfamília S4 de potássio dependentes da voltagem (Kv) canais, para o qual um número de afinidade nanomolar e moduladores de toxinas peptídicas altamente selectivos foram descobertos 3. A toxina de veneno de abelha tertiapin e seus derivados são inibidores potentes da Kir1.1 Kir3 e canais de 4,5, mas os péptidos são de uso limitado terapeuticamente bem como experimentalmente devido às suas propriedades antigénicas e de biodisponibilidade pobre, a estabilidade metabólica e a penetrância do tecido. O desenvolvimento de potentese selectivos de pequenas moléculas sondas com propriedades farmacológicas melhoradas será a chave para a plena compreensão da fisiologia e potencial terapêutico de canais Kir. O Molecular Libraries Sondas de Produção Centro de Rede (MLPCN), apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Fundo Comum criou oportunidades para os cientistas acadêmicos para iniciar campanhas de sonda de detecção de alvos moleculares e vias de sinalização que necessitam de melhor farmacologia 6. O MLPCN fornece aos pesquisadores acesso aos centros de indústria em escala de triagem e química medicinal e informática de apoio para desenvolver moléculas pequenas sondas para elucidar a função dos genes e redes de genes. O passo crítico para a admissão ao MLPCN é o desenvolvimento de um ensaio de meta-ou via específica robusto que é tratável através de rastreio de alto rendimento (HTS). Aqui, descrevemos como desenvolver uma fluorescência baseada em tálio (Tl +) fluxo assay de Kir função do canal de rastreio de alto rendimento composto 7,8,9,10. O ensaio é baseado sobre a permeabilidade do canal de K + de poro para o composto aparentado + K + Tl. A comercialmente disponível fluorescente Tl + corante repórter é utilizado para detectar o fluxo transmembranar de Tl + através do poro. Existem pelo menos três corantes disponíveis comercialmente que são adequados para os ensaios de fluxo de Tl +: BTC, FluoZin-2, e FluxOR 7,8. Este protocolo descreve o desenvolvimento do ensaio usando FluoZin-2. Embora originalmente desenvolvidos e comercializados como um indicador de zinco, FluoZin-2 apresenta um aumento robusto e dose-dependente, na emissão de fluorescência após a ligação Tl +. Começamos a trabalhar com FluoZin-2 antes FluxOR estava disponível 7,8 e continuaram a fazê-lo 9,10. No entanto, os passos no desenvolvimento do ensaio são essencialmente idênticas para todas as três corantes, e os utilizadores devem determinar quais corante é mais apropriada para o seu n específicoeeds. Discutimos, também, referência do ensaio de desempenho que devem ser alcançados a ser considerado para a entrada no MLPCN. Desde Tl + facilmente permeia a maioria dos canais de K +, o ensaio deve ser adaptável para a maioria dos objectivos de K + channel.

A utilização de um sistema de expressão induzível por tetraciclina fornece um controle interno conveniente para distinguir Tl + fluxo através de vias endógenos e do canal Kir de interesse. Figura 1 mostra alguns exemplos de mapas de células de revestimento utilizados em diferentes tipos de ensaios. As posições dos poços que contêm as células não induzidas ou induzida por tetraciclina são indicados com cores diferentes. Figura 2A mostra o mapa da placa de base ut...

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High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Os métodos para o desenvolvimento e validação de um ensaio quantitativo de fluorescência para medir a actividade de potássio rectificador de entrada (Kir) canais de rastreio de alto rendimento composto é apresentado.

High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

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