Name: high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la financiación de los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 1R21NS073097-01 y 1R01DK082884 (JSD) y la Fundación para los Institutos Nacionales de subvención PIER11VCTR.

1. Generación de líneas celulares estables policlonales <ol><li> El establecimiento de una línea celular estable que expresa la alta calidad del canal Kir de interés es un primer paso importante hacia el desarrollo de un sólido de alto rendimiento ensayo de cribado. Constitutiva sobreexpresión canal K + puede conducir a la activación de las vías de muerte celular, degeneración estable línea celular y la pérdida de rendimiento del ensayo. Para evitar estos posibles problemas y proporcionar un cont...

<ol>
	<li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy.">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129 (2008).</li><li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K++channels:+recent+advances+and+future+possibilities.">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757 (2010).</li><li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels.">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213 (2007).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291 (1998).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin:+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286 (1999).</li><li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain:+a+Mount+Everest+in+the+making.">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764 (2010).</li><li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thallium-sensitive,+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells.">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671 (2004).</li><li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and.">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094 (2009).</li><li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1,+the+renal+outer+medullary+potassium+channel.">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42 (2011).</li><li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization,+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+(Kir)+channels+with+preference+for+Kir2.3,+Kir3.x,+and+Kir7.1.">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75 (2012).</li><li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213 (2008).</li></ol>

Tratamiento de datos: Una vez recogidos los datos, un paso común en el análisis consiste en la normalización de la respuesta de fluorescencia de cada pocillo, F, a su valor inicial al comienzo del experimento, F 0. Esto se conoce comúnmente como la &quot;relación estática&quot; y simbolizado &quot;F / F 0&quot;. En los casos en que F 0 está dominado por el colorante indicador de la relación de operación estática sustancialmente para corregir muchos f...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Inducible por tetraciclina vector de expresión </td></tr><tr><td> T-Rex-células HEK293 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> La tetraciclina-inducible línea celular </td></tr><tr><td> LTX Lipofectamine / Plus reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Reactivo de transfección </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biológicos </td><td> S11550 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Medios de cultivo celular </td></tr><tr><td> HBSS-divalente libre </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Lavado de células </td></tr><tr><td> Tripsina 0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Disociación celular </td></tr><tr><td> Tetraciclina-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Inducción reactivo </td></tr><tr><td> FBS dializado </td><td> ATLANTA Biológicos </td><td> S12650 </td><td> Medios de comunicación Revestimiento </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Colorante fluorescente </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Dye carga </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Tampón de ensayo </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Tampón de ensayo </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> Sulfato de talio </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + estímulo tampón </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Ocho canales pipeta electrónica </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Célula de recubrimiento en el 384 -y placas </td></tr><tr><td> BD PureCoat amina recubiertos con placas de 384 pocillos </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Ensayo de microplacas </td></tr><tr><td> Echo calificado 384-así microplacas de polipropileno (384pp) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> Microplacas compuesto fuente </td></tr><tr><td> 384-y microplacas de polipropileno </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi dispensador de reactivo </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 Lavador de microplacas </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Lavado automático de células </td></tr><tr><td> Echo manipulador de líquidos </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo automatizado plataforma de manejo de líquidos </td><td> Agilent Technologies </td><td> Modelo estándar </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetic imaging lector de placas </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Lista de Materiales y Reactivos.

high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels

Miembros específicos de la familia rectificador de potasio hacia el interior del canal (Kir) se postulan dianas de fármacos para una variedad de trastornos, incluyendo la hipertensión, fibrilación auricular, y 1,2 dolor. En su mayor parte, sin embargo, el progreso hacia la comprensión de su potencial terapéutico o funciones fisiológicas incluso básicos ha sido retrasado por la falta de buenos herramientas farmacológicas. En efecto, la farmacología molecular de la familia rectificador interno se ha quedado muy por detrás del de la superfamilia de S4 de potasio dependientes de voltaje (Kv) canales, para lo cual se han realizado una serie de afinidad nanomolar y péptidos moduladores selectivos de la toxina altamente descubiertos 3. El veneno de abeja tertiapin toxina y sus derivados son potentes inhibidores de Kir1.1 y Kir3 canales de 4,5, pero los péptidos son de uso limitado terapéuticamente así como experimentalmente, debido a sus propiedades antigénicas y una escasa biodisponibilidad, estabilidad metabólica y la penetrancia tejido. El desarrollo de potentesy selectivos de molécula pequeña sondas con mejores propiedades farmacológicas será una clave para un completo entendimiento de la fisiología y el potencial terapéutico de los canales Kir. El Bibliotecas Molecular Sondas Centro de Producción de red (MLPCN), apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Fondo Común ha creado oportunidades para los científicos académicos para iniciar campañas de detección de la sonda para dianas moleculares y vías de señalización que necesitan una mejor farmacología 6. El MLPCN ofrece a los investigadores acceso a los centros de cribado a escala industrial y química médica y la informática apoyar el desarrollo de pequeñas moléculas sondas para elucidar la función de los genes y las redes de genes. El paso crítico en la obtención de la entrada a la MLPCN es el desarrollo de un ensayo robusto diana específica o vía-que es susceptible de cribado de alto rendimiento (HTS). Aquí se describe cómo desarrollar una fluorescencia basada en talio (Tl +) flujo ASSAy de Kir función del canal para la investigación de compuestos de alto rendimiento 7,8,9,10. El ensayo se basa en la permeabilidad de la K + poro del canal para el K + Tl + congénere. A comercialmente disponibles fluorescente Tl + colorante reportero se utiliza para detectar flujo transmembrana de Tl + a través del poro. Hay por lo menos tres colorantes comercialmente disponibles que son adecuados para TL + ensayos de flujo: BTC, FluoZin-2, y Fluxor 7,8. Este protocolo describe el desarrollo del ensayo utilizando FluoZin-2. Aunque originalmente desarrollado y comercializado como un indicador de zinc, FluoZin-2 exhibe un aumento robusto y dependiente de la dosis en la emisión de fluorescencia tras la unión Tl +. Comenzamos a trabajar con FluoZin-2 antes estaba disponible Fluxor 7,8 y han seguido haciéndolo 9,10. Sin embargo, los pasos en el desarrollo del ensayo son esencialmente idénticas para los tres tintes, y los usuarios deben determinar qué colorante es más apropiado para su específico nEEDS. También se discuten los puntos de referencia del ensayo de rendimiento que se deben alcanzar para ser considerado para la entrada en el MLPCN. Desde Tl + penetra fácilmente la mayoría de los canales de K +, el ensayo debe ser adaptable a la mayoría de los objetivos de los canales de K +.

El uso de un sistema de expresión inducible por tetraciclina proporciona un conveniente control interno para distinguir Tl + flujo a través de las vías endógenas y el canal Kir de interés. Figura 1 muestra algunos ejemplos de los mapas de galvanoplastia celulares utilizadas en diferentes tipos de experimentos. Las posiciones de los pocillos que contienen células no inducidas o tetraciclina inducida-se indican con diferentes colores. Figura 2A muestra el mapa de placa de...

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High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Los métodos para desarrollar y validar un ensayo cuantitativo de fluorescencia para medir la actividad de potasio rectificador de entrada (Kir) canales para la investigación de compuestos de alto rendimiento se presenta.

De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

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