Name: high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels at JoVE.com

Detta arbete stöddes av medel från National Institutes of Health bidrag 1R21NS073097-01 och 1R01DK082884 (JSD) och fonden för National Institutes bidraget PIER11VCTR.

1. Generering av stabila Polyklonala cellinjer <ol><li> Inrättandet av en hög kvalitet stabil cellinje som uttrycker Kir-kanalen av intresse är ett viktigt första steg mot att utveckla en robust high-throughput screening-analysen. Konstitutiv K + kanalen överuttryck kan leda till aktivering av vägar med celldöd, stabil cellinje degeneration och förlust av analysens prestanda. För att undvika dessa potentiella problem och ger en bekväm intern kontroll för analys utveckling (se nedan), är en tetra...

<ol>
	<li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy.">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129 (2008).</li><li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K++channels:+recent+advances+and+future+possibilities.">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757 (2010).</li><li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels.">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213 (2007).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291 (1998).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin:+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286 (1999).</li><li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain:+a+Mount+Everest+in+the+making.">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764 (2010).</li><li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thallium-sensitive,+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells.">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671 (2004).</li><li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and.">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094 (2009).</li><li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1,+the+renal+outer+medullary+potassium+channel.">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42 (2011).</li><li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization,+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+(Kir)+channels+with+preference+for+Kir2.3,+Kir3.x,+and+Kir7.1.">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75 (2012).</li><li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213 (2008).</li></ol>

Data behandling: När data samlas in, innebär en gemensam steg i analysen normalisera varje brunn är fluorescens svar, F, till sitt ursprungliga värde vid början av experimentet, F 0. Detta brukar kallas &quot;statiska förhållandet&quot; och symboliserade &quot;F / F 0&quot;. I de fall där F 0 domineras av indikatorfärgämnet den statiska förhållandet operationen väsentligt kommer att korrigera för många faktorer som disuniformities i belysning, s...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Tetracyklin-inducerbar expressionsvektor </td></tr><tr><td> T-rex-HEK293-celler </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Tetracyklin-inducerbar cellinje </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / Plus Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Transfektionsreagens </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Cellodlingsmedia </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11.965 </td><td> Cellodlingsmedia </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Cellodlingsmedia </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Cellodlingsmedia </td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15.140 </td><td> Cellodlingsmedia </td></tr><tr><td> HBSS-tvåvärd fri </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Cell tvätt </td></tr><tr><td> Trypsin-0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Cell dissociation </td></tr><tr><td> Tetracyklin-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Induktion reagens </td></tr><tr><td> Dialyserad FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Plating medier </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Fluorescerande färgämne </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Dye Loading </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14.175 </td><td> Analysbuffert </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15.630 </td><td> Analysbuffert </td></tr><tr><td> NaHCOs 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + stimulans buffert </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + stimulans buffert </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + stimulans buffert </td></tr><tr><td> D-glukos </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + stimulans buffert </td></tr><tr><td> Tallium sulfat </td><td> Aldrich </td><td> 204.625 </td><td> Tl + stimulans buffert </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + stimulans buffert </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Lösningsmedel </td></tr><tr><td> Åtta-kanals elektronisk pipett </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Cell plätering i 384 -brunnsplattor </td></tr><tr><td> BD PureCoat amin-belagda 384-brunnsplattor </td><td> BD Biosciences </td><td> 356.719 </td><td> Assay mikroplattor </td></tr><tr><td> Echo kvalificerade 384-Well polypropylen mikroplatta (384PP) </td><td> Labcyte </td><td> P-05.525 </td><td> Sammansatta källa mikroplattor </td></tr><tr><td> 384-brunnars mikroplattor polypropylen </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781.280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi reagensdoseranordningen </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 mikroplatta bricka </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Automatiserad cell tvätt </td></tr><tr><td> Echo flytande hanterare </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo automatiserad vätskehantering plattform </td><td> Agilent Technologies </td><td> Standardutförande </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetisk avbildning plattläsare </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Förteckning över material och reagens.

high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels

Specifika medlemmar av inre likriktare kalium (KIR) kanal familj postulerade läkemedelsmål för olika sjukdomar, inklusive högt blodtryck, förmaksflimmer, och smärta 1,2. För det mesta har dock framsteg mot att förstå deras terapeutiska potential eller ens grundläggande fysiologiska funktioner har bromsats av bristen på goda farmakologiska verktyg. I själva verket har den molekylära farmakologi för aktiv likriktare familjen släpat långt efter S4 superfamiljen av spänningskänsliga kalium (kV) kanaler, där ett antal nanomolar affinitet och mycket selektiva peptid modulatorer toxin har upptäckts 3. Den bigift toxin tertiapin och dess derivat är potenta hämmare av Kir1.1 och Kir3 kanaler 4,5, men peptiderna är av begränsad användning terapeutiskt liksom experimentellt på grund av deras antigena egenskaper och dålig biotillgänglighet, metaboliska stabilitet och vävnad penetrans. Utvecklingen av potentaoch selektiva små molekyler sonder med förbättrade farmakologiska egenskaper kommer att vara en nyckel till fullo förstå fysiologi och terapeutiska potentialen hos Kir-kanaler. Den molekylära bibliotek Sonder Production Center Network (MLPCN) som stöds av National Institutes of Health (NIH) gemensamma fonden har skapat möjligheter för akademiska forskare att inleda sond upptäckt kampanjer för molekylära mål och signalvägar i behov av bättre farmakologi 6. Den MLPCN ger forskare tillgång till industri-screening centra och läkemedelskemi och informatik stöd för att utveckla små molekyler sonder att belysa funktionen hos gener och nätverk gen. Det kritiska steget i att få inträde till MLPCN är utvecklingen av en robust mål-eller vägen-specifik analys som är mottaglig för high-throughput screening (HTS). Här beskriver vi hur man kan utveckla en fluorescens-baserad tallium (Tl +) flux assay Kir kanalens funktion för high-throughput screening förening 7,8,9,10. Analysen är baserad på permeabiliteten hos K + kanalen por till K + kongenen Tl +. En kommersiellt tillgänglig fluorescerande Tl + reporterfärgämnet används för att detektera transmembranflödet av Tl + genom poren. Det finns åtminstone tre kommersiellt tillgängliga färgämnen som är lämpliga för TL + flux analyser: BTC, FluoZin-2 och FluxOR 7,8. Detta protokoll beskriver analys utveckling med FluoZin-2. Även ursprungligen utvecklades och marknadsförs som en zink indikator, FluoZin-2 uppvisar en robust och dosberoende ökning av fluorescensemission på Tl + bindning. Vi började arbeta med FluoZin-2 innan FluxOR fanns 7,8 och har fortsatt att göra det 9,10. Men stegen i analysen utveckling är i huvudsak identiska för alla tre färger, och användarna bör avgöra vilken färg som är mest lämplig för deras specifika NEEDS. Vi diskuterar också analysens prestandatester som måste nås för att komma i fråga för tillträde till MLPCN. Eftersom Tl + lätt genomsyrar de flesta K +-kanaler, bör analysen kunna anpassas till de flesta K + kanaler mål.

Användningen av en tetracyklin-inducerbart uttryckssystem ger en bekväm intern kontroll för att skilja Tl + flödet genom endogena vägar och Kir kanalen av intresse. Figur 1 visar några exempel på kartor cell plätering används i olika typer av experiment. Positionerna för brunnar innehållande oinducerade eller tetracyklin-inducerade celler indikeras med olika färger. Figur 2A visar kartan källplattan som används för att bestämma den optimala Tl +-koncentra...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels at JoVE.com

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Metoder för att utveckla och validera en kvantitativ fluorescens analys för att mäta aktiviteten av inre likriktare kalium (KIR) kanaler för high-throughput förening screening presenteras.

High-throughput screening för små molekyler Modulatorer för aktiv kanaler Likriktare Kalium

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Småmolekylära skärm

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Hög throughput screening av svamp Endoglucanase aktivitet i Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

En fluorescerande screeningsanalys för att identifiera modulatorer av GIRK kanaler

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Hög kapacitet Funktionell Screening med hjälp av en hemmagjord Dual-glöd luciferas analys

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Ett förfarande för Permeabilization av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon för analyser av Small Molecule aktivitet

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

En handbok Small Molecule Screen Närmar hög kapacitet Använda Zebrafish embryon

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identifiering av kinas-substrat par Använda högkapacitetsscreening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...