Name: high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels at JoVE.com

Bu çalışma Sağlık hibe 1R21NS073097-01 ve 1R01DK082884 (JSD) ve National Institutes hibe PIER11VCTR Vakfı National Institutes of fon tarafından desteklenmiştir.

1. Kararlı Poliklonal Hücre Hatları Üretimi <ol><li> Ilgi Kir kanalı ifade eden bir yüksek kalite istikrarlı hücre hattı kurulması sağlam yüksek çıktılı tarama testi geliştirme yolunda önemli bir ilk adımdır. Kurucu K + kanal ekspresyonu hücre ölümü yollar, kararlı hücre hattı dejenerasyon ve tahlil performans kaybı aktivasyonuna yol açabilir. Bu potansiyel sorunları önlemek ve analiz gelişimi için uygun bir iç kontrol (aşağıya bakınız) sağlamak için, bir tetrasiklin...

<ol>
	<li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy.">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129 (2008).</li><li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K++channels:+recent+advances+and+future+possibilities.">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757 (2010).</li><li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels.">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213 (2007).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291 (1998).</li><li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin:+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K++channels.">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286 (1999).</li><li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain:+a+Mount+Everest+in+the+making.">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764 (2010).</li><li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thallium-sensitive,+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells.">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671 (2004).</li><li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and.">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094 (2009).</li><li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1,+the+renal+outer+medullary+potassium+channel.">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42 (2011).</li><li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterization,+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+(Kir)+channels+with+preference+for+Kir2.3,+Kir3.x,+and+Kir7.1.">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75 (2012).</li><li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+of+Gi/o-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors.">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213 (2008).</li></ol>

Veri işlem: Bir kez veri analizi, ortak bir denemede, F 0 başında başlangıç ​​değerinin her bir kuyunun floresan tepki, F, normalize içerir toplanır. Bu genellikle &quot;statik oran&quot; olarak adlandırılır ve &quot;F / F 0&quot; sembolize edilir. F 0 İndikatör boya hakim olduğu durumlarda statik oranı operasyonu büyük ölçüde, aydınlatma, sinyal toplama disuniformities gibi birçok faktörler düzeltecektir ve hücre sayı...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Tetrasiklin-indüklenebilir ifade vektörü </td></tr><tr><td> T-Rex-HEK293 hücrelerine </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Tetrasiklin-indüklenebilir hücre hattı </td></tr><tr><td> Lipofektamin LTX / Artı Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Transfeksiyon reaktifi </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biyolojik </td><td> S11550 </td><td> Hücre kültürü ortamı </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Hücre kültürü ortamı </td></tr><tr><td> Higromisin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Hücre kültürü ortamı </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Hücre kültürü ortamı </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Hücre kültürü ortamı </td></tr><tr><td> Ücretsiz HBSS-divalent </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Hücre yıkama </td></tr><tr><td> Tripsin-% 0.25 &#39; </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Hücre ayrışma </td></tr><tr><td> Tetrasiklin-HCI </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> İndüksiyon reaktifi </td></tr><tr><td> Diyalizlenmiş FBS </td><td> ATLANTA Biyolojik </td><td> S12650 </td><td> Kaplama medya </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Floresan boya </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Boya yükleme </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Tahlil tampon </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Tahlil tampon </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + uyarıcı tampon </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + uyarıcı tampon </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + uyarıcı tampon </td></tr><tr><td> D-Glikoz </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + uyarıcı tampon </td></tr><tr><td> Talyum sülfat </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + uyarıcı tampon </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + uyarıcı tampon </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Çözücü </td></tr><tr><td> Sekiz kanallı elektronik pipet </td><td> BIOHIT </td><td> E300 </td><td> 384 Hücre kaplama -kuyucuğu </td></tr><tr><td> BD PureCoat amin kaplı 384 oyuklu plakalar </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Assay mikroplaklar </td></tr><tr><td> Echo 384-Eh polipropilen mikroplak (384PP) nitelikli </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> Bileşik kaynağı mikroplaklar </td></tr><tr><td> 384-iyi polipropilen mikroplaklar </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Kombi reaktif dağıtıcı </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 mikroplak yıkayıcı </td><td> Biotek </td><td> ELx405HT </td><td> Otomatik hücre yıkama </td></tr><tr><td> Sıvı işleyici Echo </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo otomatik sıvı taşıma platformu </td><td> Agilent Technologies </td><td> Standart model </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetik görüntüleme plaka okuyucu </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Materyal ve Reaktifler listesi.

high-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels

Içe doğrultucu potasyum (Kir) kanal aile Özgül üyeleri hipertansiyon, atriyal fibrilasyon, ve ağrı 1,2 dahil olmak üzere çeşitli hastalıkları için ilaç hedefleri öne vardır. Çoğunlukla, ancak, onların terapötik potansiyeli hatta temel fizyolojik fonksiyonlarını anlamak doğru ilerleme iyi farmakolojik araçların eksikliği yavaşlatıldı. Nitekim, dahilde doğrultucu ailesinin moleküler farmakoloji kadar nanomolar-afinite ve yüksek selektif peptid toksin modülatörleri sayısı 3 keşfedilmiş olan voltaj bağımlı potasyum (Kv) kanalları, S4 süperailesinin gerisinde kalmıştır. Arı zehiri tertiapin toksin ve bunun türevleri 4,5 Kir1.1 ve Kir3 kanallarının potent inhibitörleri olan, fakat peptidler deneysel tedavi edici olarak hem de sınırlı kullanımlı bunların antijenik özelliklere ve zayıf biyo-, metabolik stabilite ve doku penetrans bağlıdır. Güçlü bir geliştirmeve gelişmiş farmakolojik özellikleri ile seçici küçük moleküllü probları tam fizyoloji ve Kir kanallar terapötik potansiyelini anlamak için bir anahtar olacaktır. Akademik bilim adamları daha iyi farmakoloji 6 ihtiyacı moleküler hedefler ve sinyal yolları için prob keşif kampanyalar başlatmak için Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen Moleküler Kütüphaneler Sondalar Üretim Merkezi Ağ (MLPCN) (NIH) Ortak Fon fırsatlar yaratmıştır. MLPCN araştırmacılar sanayi ölçekli tarama merkezleri ve tıbbi kimya ve bilişim genler ve gen ağlarının işlevi aydınlatmak için küçük-molekül probları geliştirmeniz için size destek erişim sağlar. MLPCN giriş kazanıyor kritik adım yüksek çıktılı tarama (HTS) için müsait bir sağlam hedef veya yol özgü testinin gelişmedir. Burada, bir floresans tabanlı talyum (Tl +) akı assa nasıl geliştirileceğini açıklaryüksek verimli tarama bileşik 7,8,9,10 Kir için kanal işlevi y. tahlil geçirgenlik K + K + türdeş Tl + için kanal gözenek dayanmaktadır. Ticari olarak kullanılan floresan Tl + raportör boya gözenek içinden Tl transmembran akı + tespit etmek için kullanılır. BTC, FluoZin-2, 7,8 ve FluxOR: Tl + akı deneyleri için uygun olan, en az üç ticari olarak temin boyalar bulunmaktadır. Bu protokol, FluoZin-2 kullanılarak analiz gelişimi açıklanmaktadır. Aslında gelişmiş ve çinko göstergesi olarak pazarlanan rağmen, FluoZin-2 sergiler Tl üzerine floresans emisyon + bağlayıcı bir sağlam ve doza bağımlı artış. Biz FluxOR 7,8 sunulmuştu ve böylece 9,10 yapmaya devam etmişlerdir önce FluoZin-2 ile çalışmaya başladı. Ancak, test geliştirme adımları her üç boyalar için temelde aynıdır, ve kullanıcılar kendi özel n için en uygun olan boya belirlemelidireeds. Biz de MLPCN giriş için dikkate alınması gereken ulaşmış olmalıdır test performans kriterleri tartışacağız. Tl + kolayca en K + kanalları nüfuz bu yana, tahlil en K + kanal hedeflerine uyarlanabilir olmalıdır.

Bir tetrasiklin-indüklenebilir ifade sisteminin kullanımı endojen ve faiz Kir kanalıyla Tl + akı ayırmak için uygun bir iç kontrol sağlar. Şekil 1, deney farklı türde kullanılan hücre kaplama haritaları bazı örnekler. Uninduced ya da tetrasiklin ile indüklenen hücre içeren kuyu konumları farklı renk ile gösterilmiştir. Şekil 2A analiz gelişimi ve Bileşik elemesi için optimum Tl + konsantrasyonu belirlemek için kullanılan kaynak plaka h...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels at JoVE.com

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Içe doğru doğrultucu potasyum (Kir), yüksek verim Bileşik elemesi için kanal aktivitesini ölçmek için nicel bir floresan deneyi geliştirilmesi ve doğrulanması için yöntemler sunulmaktadır.

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Büyük Ölçekli Zebra balığı Tabanlı In vivo Küçük Molekül Ekran

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Geçirgenliği için bir yöntem<em&gt; Drosophila</emKüçük Molekül Faaliyet Tahliller için&gt; Embriyolar

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...