Name: fluorescent in situ hybridization on mitotic chromosomes of mosquitoes
Uploaded: 2012-09-17T12:00:00
Duration: 9 min
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우리는 아노펠레스의 염색체 준비와 물고기의 도움을 세르게이 Demin와 타티아나 Karamysheva 감사드립니다. 우리는 또한 텍스트를 편집 우리에게 Aedes과 Culex 게놈 DNA BAC 클론과 멜리사 웨이드를 제공하기 위해 데이비드 Severson 감사드립니다. 1R21 AI88035-01 마리아 V. Sharakhova와 1R21 AI094289-01에 이고르 V. Sharakhov :이 작품은 국립 보건원에서 두 보조금에 의해 지원되었다.

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	<li>Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V., Verrity, J. F., Abbington, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromosome Mapping Research Developments. , (2008).</li><li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298, 129-149 (2002).</li><li>Sharakhova, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+the+Anopheles+gambiae+PEST+genome+assembly.">Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly.</a> Genome biology. 8, R5 (2007).</li><li>Campos, J., Andrade, C. F., Recco-Pimentel, S. 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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

모기 mitotic 염색체에 원위치 하이브리드 화에 Nonfluorescent는 A. 쿠마르와 K. 라이 17에 의해 1990 년에 처음으로 공연되었다. 이 연구에서, 18S와 28S ribosomal DNA의 유전자는 플라스미드 하나에 함께 복제 된 모기 중 20 종의 염색체에 배치되었습니다. DNA 프로브는 radioactively 표시 및 뇌 신경절에서 염색체에 hybridized되었다. 세 모기 장군 중에서 물고기 기술은 애의 세포 라인에서 mitotic 염색체을 위해 개발되었습니다. aegypti 10,18,19하며 라이브 모기에서 mitotic 염색체에서 수행 된 적이있다. 최근, 우리는 4 일 instar의 애벌레 9의 ID에서 높은 품질의 염색체 준비를 얻기위한 간단하고 강력한 기술을 개발했다. 이 방법은 염색체의 높은 번호가 하나의 슬라이드에서 얻을 수 할 수 있으며, 보편적 모기의 모든 종에 사용될 수 있습니다. 만 애벌레의, pupal 또는 성인되지 역을 사용하는 필요성모기 릿지는 슬라이드 준비에 아마 방법의 한계입니다. 표준 생선 방법 12 Aedes, Culex, 그리고 아노펠레스의 mitotic 염색체에 대한 프로브로 게놈 BAC 클론과 IGS rDNA를 사용에 최적화되었습니다. 이러한 특정 응용 프로그램뿐만 아니라, 여기에 설명 된 생선 프로토콜은 다른 목적을 위해 사용할 수 있습니다. 불특정 하이브리드을 차단을위한 C 0t의 DNA 분수를 활용하여 고급 생선 프로토콜은 또한 BAC 클론 또는 아노펠레스의 heterochromatic 지역의 다른 큰 DNA 조각의 하이브리드에 적용 할 수 있습니다. Heterochromatic 지역은 transposable 요소와 다른 반복과 풍부한,이 지역에서 프로브는 일반적으로 염색체 3 강력한 배경을 생산하고 있습니다. 라벨이없는 C 0t의 DNA 분수를 사용하면 염색체에 프로브의 불특정 하이브리드을 줄이기 위해 도움이 될 것입니다. 물고기 PR의 간단한 버전otocol 어떤 rDNA 또는 모기와 다른 곤충의 mitotic 염색체에 반복적 인 DNA 프로브에 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 아노펠레스 또는 Drosophila 등의 euchromatic 지역에서 낮은 반복적 인 DNA 콘텐츠가 포함 된 종의 BAC 클론의 DNA의 하이브리드에 적용 할 수 있습니다. 여기에 제안 된 프로토콜은 모기에 대한 높은 완성 된 염색체 기반의 게놈 어셈블리를 얻을하는 데 도움이되며, 널리 곤충의 다른 그룹에서 다양한 cytogenetic 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> MZ6 Leica의 stereomicroscope </td><td> Leica </td><td> VA-OM-E194-354 </td><td> 다른 stereomicroscope를 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 올림푸스 CX41 위상 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> CX41 </td><td> 다른 위상 현미경을 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 올림푸스 BX61 형광 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> BX61 </td><td> 다른 형광 현미경을 사용 할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> ThermoBrite 슬라이드 변성 / 하이브리드 시스템 </td><td> 애보트 분자 </td><td> 30-144110 </td><td> 가열 블록 및 습윤 챔버 역할을 </td></tr><tr><td> 해부 바늘 </td><td> 좋은 ScienceTools </td><td> 10130-10</td><td></td></tr><tr><td> 니들 홀더 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 26018-17 </td><td></td></tr><tr><td> 해부 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 15000-03 </td><td></td></tr><tr><td> 75x25 더블 불투명 마이크로 슬라이드 </td><td> 코닝 </td><td> 2949-75x25 </td><td></td></tr><tr><td> 22x22 mm 현미경 coverslips </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-544-10 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td> 고무 시멘트 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 50-949-105 </td><td></td></tr><tr><td> 아세트산 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A491-212 </td><td></td></tr><tr><td> 알코올 200 증명 </td><td> Decon 연구소 </td><td> 2701 </td><td></td></tr><tr><td> 프로피온산 </td><td> 시그마 Aldrich </td><td> 402907 </td><td></td></tr><tr><td> 염산 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 시트르산 이수화 </td><td> 피셔 과학 </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 아세테이트 trihydrate </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP334-500 </td><td></td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 피셔 과학 </td><td> S311-500 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP152-1 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Invitrogen </td><td> P5493 </td><td></td></tr><tr><td> 10% NBF (중성는 포르말린 버퍼) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> 99 % 포름 아미드 </td><td> 피셔 Scientific </td><td> BP227500 </td><td></td></tr><tr><td> Dextran 황산 나트륨 소금 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D8906 </td><td></td></tr><tr><td> 20x SSC 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> AM9765 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ㎜ 유유-1 요오드화물 (509분의 491) 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> Y3601 </td><td></td></tr><tr><td> 골드 시약을 연장 Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=P36930" target="_blank">P36930</a> </td><td></td></tr><tr><td> dATP, dCTP, dGTP, dTTP </td><td> Fermentas </td><td> R0141, R0151, R0161, R0171 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3-dUTP, Cy5-dUTP </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> PA53022, PA55022 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> DNA의 중합 효소 I </td><td> Fermentas </td><td> EP0041 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Fermentas </td><td> EN0521 </td><td></td></tr><tr><td> S1 Nuclease </td><td> Fermentas </td><td> EN0321 </td><td></td></tr><tr><td> DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소의 </td><td> Invitrogen </td><td> 18038-042 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 9001-99-4 </td><td></td></tr><tr><td> 펩신 </td><td> USB </td><td> 9001-75-6 </td><td></td></tr><tr><td> 연어 정자 DNA </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D7656 </td><td></td></tr><tr><td> Nonidet-P40 (NP40) </td><td> 미국 생물 </td><td> NC9375914 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen의 혈액과 세포 배양 Maxikit </td><td> Qiagen </td><td> 13,362 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen 대형 건립 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 12,462 </tD&gt; <td></td></tr></tbody></table>

fluorescent in situ hybridization on mitotic chromosomes of mosquitoes

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 정기적으로 DNA와 RNA 프로브의 염색체 위치를 결정하기 위해 여러 실험실에서 사용하는 기술입니다. 이 방법의 중요한 응용 프로그램은 다양한 생물의 게놈 어셈블리를 개선하기위한 유용한 고품질의 물리적지도의 개발입니다. polytene와 mitotic 염색체의 자연 구간 패턴은 게놈 supercontigs의 정확한 순서와 방향에 대한 지침을 제공합니다. 즉 세 모기 장군, 아노펠레스, Aedes, 그리고 Culex, 중 잘 알려진 염색체 기반의 매핑 기술은 누구의 회원 읽을 수 polytene의 염색체 1을을 가지고 아노펠레스에 대한 개발되었습니다. 게놈 매핑 노력의 88 %의 결과로. gambiae 게놈은 정확한 염색체 위치 2,3에 배치되었습니다. 두 개의 다른 모기 장군, Aedes과 Culex는 제대로 염색체 B를 polytenized 한자신의 genomes 4, 5, 6 transposable 요소의 중요한 overrepresentation의 ecause. 게놈 supercontings 만 31, 9 %는 애의 염색체 명령 또는 방향없이 지정되었습니다. 각각 aegypti 7 CX. quinquefasciatus 8. 이 두 종에 대한 Mitotic의 염색체 준비는 이전에 뇌 신경절과 셀 라인으로 제한 하였다. 그러나, 모기의 뇌 신경절에서 준비 염색체 슬라이드는 일반적으로 metaphase 판 9 낮은 숫자가 포함되어 있습니다. 또한, 물고기 기술이 애의 셀 줄에서 mitotic 염색체을 위해 개발되었습니다 있지만. aegypti 10, 셀 라인 염색체 11에있는 여러 염색체 rearrangements의 축적 게놈지도에 그들을 쓸모합니다. 여기 4 일 instar의 애벌레의 imaginal 디스크 (IDS)에서 높은 품질의 mitotic의 염색체 준비를 얻기위한 간단하고 강력한 기술을 설명하는 C이 모기의 세 장군을 위해 사용될 수 없습니다. 표준 생선 프로토콜 12 애의 mitotic 염색체에 프로브로 게놈 DNA의 BAC 클론의 사용에 최적화되어 있습니다. aegypti 및 CX. quinquefasciatus와의 프로브로 intergenic 스페이서 (IGS) ribosomal DNA의 지역 (rDNA)를 이용하십시오. gambiae 염색체가. 물리적 매핑뿐만 아니라, 개발 된 기술은 인구 cytogenetics와 염색체 분류 / 모기와 다른 곤충 그룹의 systematics에 적용 할 수 있습니다.

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Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

즉 세 모기 장군, 중<em&gt; 아노펠레스,</em&gt;<em&gt; Aedes</em&gt; 및<em&gt; Culex</em&gt;, 물리적 게놈 매핑 기술은 전용 설립되었다<em&gt; 아노펠레스</em&gt;, 누구의 회원 읽을 수 polytene 염색체를 가지고 있습니다. 의 장군에 대한<em&gt; Aedes</em&gt;와<em&gt; Culex</em&gt; 그러나, cytogenetic 매핑 때문에 polytene 염색체의 품질에 도전 남아 있습니다. 여기 고품질의 mitotic 염색체의 준비와 모기의 세 장군을위한 최적화 된 생선 프로토콜을 얻기위한 범용 프로토콜을 제시한다.

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