Name: mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens at JoVE.com

DZ understøttes af MD Anderson Cancer Center og NIH tilskud AI079232. MD Anderson Cancer Center er delvist understøttet af NIH tilskud CA16672.

1. Lab Sikkerhedsspørgsmål <ol><li> Alle organiske opløsningsmidler skal opbevares på specifikke områder med tydelig mærkning. Se etiketter ved fremstiller for typer af brand krævede ildslukkere. </li><li> Adskillige anvendte reagenser er potentielt kræftfremkaldende, og kan forårsage mental depression. Disse reagenser skal håndteres i en kemisk hætte med ventilation (se tabel af specifikke reagenser og udstyr til detaljerne). </li><li> Det anbefales, at når man arbejder med organiske opløsningsmidler og celler, personlige værnemidler såsom handsker, laboratoriekittel, og øjenbeskyttelse udnyttes på alle tidspunkter. </li></ol> 2. Ekstraktion af glycosphingolipider fra rotte-leukæmiceller <ol><li> Store RBL rotte leukæmiceller 8 (10.000.000 til 100.000.000) i 16x100 mm glasrør under -80 ° C betingelser. Celler tælles med et hæmocytometer efter trypanblåt-farvning. Levedygtigheden af ​​celler, bør være højere end 95%. </li><li> Uddrag lipiderne ved hjælp af omfattende sonication fire gange i 1-2 timer hver med blandede polaritet opløsningsmidler. Brug 6 ml chloroform-methanol 1:1 (v / v) som den første og sidste opløsningsmiddel. Seks ml isopropanol: hexan: H2O 55:25:20 (vol / vol / vol, fjernes øvre fase ved aspiration før brug) kan derefter anvendes som det andet og tredje opløsningsmiddel. Dette opløsningsmiddel fremstilles ved at blande isopropanol: hexan: H2O i et 55:25:20-forhold under kraftig omrystning, og tillader en øvre fase skal vises, som vil blive fjernet. Holde den nederste fase til anvendelse. </li><li> Følg lydbehandling med centrifugering for at pelletere det uopløselige materiale. Supernatanterne. Tørre dem i en Speedvac i 4 timer. Nitrogenstrøm eller rotationsfordamper kan anvendes, hvis Speedvac ikke er tilgængelig. Brug en god kold fælde at holde fordampet organiske opløsningsmidler. Forurening af organisk opløsningsmiddel i vakuumpumpen olien vil forringe effektiviteten af ​​vakuumpumpen. </li><li> Udføre en foreløbig analyse ved hjælp af højtydende tyndtlagskromatografi (HPTLC). For at kvantificere glycolipider, Fremstilling af en 0,2% Orcinol i 50% svovlsyre opløsning (100 mg i 50 ml) og en Galactose standard (40 mg i 100 ml stamopløsning). Forberede i 30 ul reaktionsvolumen en række fortyndinger til brug som standardkurve (fra 0 g / L til 20 g / L). Der tilsættes 20 pi methanol til hver fortyndingsrække prøve. Opløs hvert glycolipid prøve i 200 pi methanol, der sonikeres og anvende 20 ul for glycolipid mængde måling. I 1,5 ml Eppendorf-rør med gevind hætter (Sarstedt, 72.692.005), tilsættes 0,4 ml 0,2% Orcinol i 50% svovlsyreopløsning til hver prøve, med en række Galactose-H2O-methanol løsninger, der tjener til standardkurve . Koges i 5 minutter i varmeblok ved 100 ° C. Læse optiske densitet af farvereaktion ved 440 nm under anvendelse af Sunrise Tecan Microplate Reader. For at udføre HPTLC, anvender chloroform: methanol: H2O 60:35:8 (v / v / v) som opløsningsmiddel for de neutrale lipider blev behandlet med chloroform-methanol 1:1 (v / v). Anvende isopropanol: hexan: H2O 55:25:20 (vol / vol / vol) somopløsningsmidlet for de sure lipider (gangliosider). De isolerede neutrale GSL&#39;er blev opløst i 200 pi opløsningsmiddel chloroform: methanol 1:1 (v / v) og fyldt på Merck silicagel tyndtlagschromatografi plade ved Drummond Microcaps. Pladerne blev kørt i opløsningsmiddel chloroform: methanol: H2O 60:35:8 (v / v / v) og tørret. Glycosphingolipider blev visualiseret ved Orcinol-svovlsyre ved 300 ° C. </li><li> For at udskille de neutrale lipider fra de sure lipider, fraktion ud de neutrale og sure lipider ved anionbytningskromatografi på en lille søjle af DEAE Sephadex A-25 [DEAE Sephadex A25 harpiksen kan fremstilles ved at gennemvæde Sephadex A-25-harpiks pulver i chloroform: methanol: H2O 30:60:8 (v / v / v) overnight. Aspirer supernatanten indtil Sephadex A25 harpiksen alt der er tilbage. Tilsættes frisk chloroform: methanol: H2O 30:60:8 (v / v / v) for at vaske harpiksen. Gentages tre gange for at fjerne de negativt ladede rester fra Sephadex A25 harpiks]. </li><li> Opløs, Sonikat (i ikke mere end 10 min), og resuspender lipiderne fra trin 2,1 i chloroform: methanol: H2O 30:60:8 (v / v / v) efter behov. </li><li> Forberede en lille DEAE Sephadex A25 (Cl Form) søjle ved anvendelse af glasuld og en 9 &quot;Pasteur-pipette. Pak glasuld omhyggeligt, så harpikspulver ikke passerer gennem søjlen. Tilføj DEAE Sephadex A25 (Cl) harpiks til&quot; Halsen &quot;af 9&quot; Pasteur-pipette uden at lade søjlen tørre. Sørg for, at du ikke kan se nogen harpiks i eluent. Prøverne opløses i chloroform: methanol: H2O 30:60:8 (v / v / v) blev opløst. Den neutrale lipidfraktion er strømmen gennem fraktion. </li><li> Eluering af sure lipidfraktion (bundet til harpikser) med 8 ml natriumacetat i methanol. Tør både de neutrale og sure fraktioner, afsalte dem ved dialyse, tørre dem af Speedvac og analysere dem ved HPTLC. </li></ol> Den sure fraktion indeholder gangliosider, som kan dialyseres for trin 3 reaktionen direkte.Den neutrale fraktion indeholder ikke kun neutrale glycosphingolipider, men også phospholipider (phosphatidylcholin og sphingomyelin), som skal fjernes ved en acetyleringsreaktion. Det er vores erfaring, at fremgangsmåden ifølge et dialyse kassette er mere effektiv og bekvem end et dialyserør eller omvendt fase C18-søjlekromatografi. <ol start="9"><li> Det næste trin er fjernelse af phospholipider fra neutrale glycosphingolipider med en acetylering og peracetylering reaktion. Tør DEAE Sephadex A-25 gennemslag fraktion i Speedvac (med afkøling) i 4 timer. Efter prøverne er tørre, læg dem tilbage i Speedvac og tørre i yderligere 4 timer. Sørg for, at disse prøver er helt tørre, som enhver resterende vand vil forhindre peracetylering reaktion. </li><li> Peracetylate prøverne med 1 ml pyridin og 0,5 ml eddikesyreanhydrid i mørke ved stuetemperatur eller 37 ° C natten over. Denne mængde pyridin og eddikesyreanhydrid er passende til optil 200 ug af glycosphingolipider. Denne reaktion kan udføres ved 37 ° C, idet GSL&#39;er har bedre opløselighed. </li><li> Tør peracetylerede materiale ved Speedvac i 3 timer, med tilsætning af 1 ml toluen 3x (coinddampning) for at sikre fuldstændig fordampning. Hvis prøverne er endnu ikke helt tørt, Speedvac indtil tør. </li><li> Der fremstilles en Florisil (Sigma-Aldrich) søjle (30 til 60 mesh, 10 × 80 mm) i en Pasteur-pipette med glasuld, ved hjælp af Florisil perler. Florisil perlerne skal tørres fuldstændigt før brug, ved inkubation i en 110 ° C ovn. Fyld perlerne i Pasteur pipette op til halsen, og ækvilibrere i 1,2-dichlorethan-hexan 4:1 (v / v). </li></ol> Eluering fra Florisil søjle er meget hurtig. Hurtig volatilitet af opløsningsmidlerne kan føre til kolonne tørring. Således alle opløsningsmiddelblandinger bør fremstilles inden gennemførelse af søjlen, da det ikke er muligt at stoppe søjlen under elueringen. <ol start="13"><li> Påfør peracetylated prøven i 1 ml 1,2-dichlorethan-hexan 4:1 (v / v), og søjlen vaskes med 6 ml af det samme opløsningsmiddel, efterfulgt af 10 ml 1,2-dichlorethan. Eluering neutrale peracetylerede GSL&#39;er med 6 ml 1,2-dichlorethan-acetone 1:1 (v / v). Dette trin fjerner den peracetylerede phospholipider fra glycosphingolipider, fordi den peracetylerede glycosphingolipider binder til Florisil søjle, medens peracetylerede phospholipider ikke gør. </li><li> Tørre fraktioner ved Speedvac i 2 timer og deacetylate med 2 ml 0,5 M natriummethoxid [Sigma-Aldrich, 403.067] i 2 ml methanol i 3 timer ved stuetemperatur. </li><li> Neutralisere blandingen med 3 ml methanoleddikesyreopløsning [eddikesyre / methanol 15/85 v / v], tør af Speedvac, desalt ved dialyse [opløses de tørrede produkter i 3 ml vand, og tilføre den Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette, dialyseres mod vand i 24 timer. Skifte vand mindst to gange]. Tør de dialyserede GSL&#39;er (i vandig opløsning) ved Speedvac indtil prøverne er helt tørre. </li&gt; </ol> 3. Kemisk modifikation (permethylering) af glycosphingolipider 13 <ol><li> Indføre GSL&#39;er (1-20 ug) til et glasrør med skruelåg og Teflon liner, og der tilsættes dimethylsulfoxid (150 ul) uden anvendelse af specielle tørringsbetingelser eller inert gasatmosfære. </li><li> Forbered pulveriseret natriumhydroxid (40-60 mg) fra natriumhydroxid partikler ved formaling dem i en kemisk morter med en støder. Sørg for at gemme pulvere i et meget tørt miljø og være omhyggelig med at gøre slibningen i den kemiske hætte for at undgå at indånde pulvere. </li><li> Næste tilføje natriumhydroxid pulveret til prøveopløsningen med en spatel. Tilsættes iodmethan (80 pl) med en 100 mikroliter Halmilton sprøjte, [eller 100 mikroliter VWR kalibreret pipette forbundet med en sprøjte gennem gummislanger kan anvendes] og rystes blandingen ved stuetemperatur i 1 time. </li><li> Stands methylering reaktionen med vand (2 ml). Udpak permethylerede produkter 3 gange vedtilsætning af dichlormethan (2 ml) [glycolipider er i dichlormethan fase, som er den nedre fase, så den øverste fase kan overføres til et nyt reagensglas, og igen ekstraheret med dichlormethan]. </li><li> Vask De kombinerede dichlormethanekstrakter 3 gange med 2 ml vand [den øvre fase, som er den vand, kan derefter bortskaffes]. Efter den sidste vask prøverne overføres til et nyt rør, og tør ved hjælp af Speedvac. </li><li> Prøver kan derefter opløst i 100 til 200 pi methanol i ESI-MS-analyse. </li></ol> 4. MALDI-TOF analyse af permethyleret Gycosphingolipids <ol><li> Udfør MALDI-TOF-MS og MALDI-TOF/TOF-MS/MS eksperimenter på en MALDI TOF-TOF massespektrometer (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Forberede matrixen ved at blande 50% volumen af ​​10 mg / ml dihydroxybenzoesyre (DHB) i acetonitril og 50% volumen af ​​0,1% trifluoreddikesyre (TFA) i vand. </li><li> DHB matrix kan være plettet på MALDI udsigt til rentenedsættelsert (1 pi), efterfulgt af en 1 pi (indeholdende 100 ng GSL&#39;er) plet af prøven opløst i methanol. Påfør langsomt og lad den tørre, før analysen. </li></ol> 5. Ion Trap MS Analyse af permethyleret glycosphingolipider <ol><li> Udføre massespektrometri på en lineær ionfælde-massespektrometer (LTQ, ThermoScientific, San Jose, CA) under anvendelse af en nanoelectrospray kilde, 0,30 gl / min ved 230 ° C kapillær temperatur i positiv ion-mode med 30-50% kollisionsenergi. Indstil sammenstød energier til at forlade en minimal residual overflod af prækursor-ion. Påvise alle ioner som natrium-addukter. </li><li> Identificer iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) i en isobarisk blanding af Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) og iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) standarder ved at sammenligne de forskellige mønstre for MS 4 produkt-ioner fra den sodiated molekylion via glycan fragment m / z 667 og terminalen disaccharid 1 - ene ion m / z 445 (dvs.X → 667 → 445 →, X betyder molekylarionen detekteres ved MS 1) af rene permethylerede iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) standarder via ESI-LIT-MS med de permethyleret Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

<ol>
	<li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+Glycosphingolipids.">Chapter 10 Glycosphingolipids.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Bendelac, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17+NKT+cells+and+other+Innate-like+T+and+B+lineages.">Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages.</a> Fundamental Immunology. , (2011).</li><li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+shigella+diarrhea.+XI.+Isolation+of+a+shigella+toxin-binding+glycolipid+from+rabbit+jejunum+and+HeLa+cells+and+its+identification+as+globotriaosylceramide.">Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide.</a> J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).</li><li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+function+of+iGb3.">The immunological function of iGb3.</a> Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).</li><li>Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+glycolipid+prevents+autoimmune+encephalomyelitis+by+inducing+TH2+bias+of+natural+killer+T+cells.">A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells.</a> Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).</li><li>Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mapping+of+glycomes:+implications+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).</li><li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus.">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li><li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+quantitation+of+isoglobotriaosylceramide+in+the+presence+of+isobaric+components+using+electrospray+ionization-ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).</li><li>Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+isoglobo+and+globo+series+tetraglycosylceramides+in+human+thymus+by+ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).</li><li>Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+permethylation+of+glycolipid,+and+polysaccharide+catalyzed+by+methylsulfonyl+carbanion+in+dimethyl+sulfoxide.">A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide.</a> J. Biochem. (Tokyo). 55, 205 (1964).</li><li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simultaneous+methylation+of+fatty+and+hydroxy+fatty+acids+for+gas-liquid+chromatographic+analysis.">Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis.</a> Carbohydr. Res. 131, 209 (1984).</li><li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li><li>Levery, S. B., Hakomori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+methylation+analysis+of+glycolipids+using+capillary+gas+chromatography-chemical+ionization+mass+fragmentography+with+selected+ion+monitoring.">Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring.</a> Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).</li><li>Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+polyfucosylated+lactosaminoglycan+from+human+granulocytes.">Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).</li><li>Ciucanu, I., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oxidative+degradation+during+the+per-O-methylation+of+carbohydrates.">Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 16213 (2003).</li><li>Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-butyldeoxygalactonojirimycin+inhibits+glycolipid+biosynthesis+but+does+not+affect+N-linked+oligosaccharide+processing.">N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.</a> J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).</li><li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47+Structural+Analysis+of+Glycans.">Chapter 47 Structural Analysis of Glycans.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib:+an+MSn+spectral+library.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li></ol>

DZ er en konsulent for BioTex, Houston, TX, og en opfinder er involveret i patenter udstedt i forbindelse med teknologier, der er nævnt i denne artikel, eller i anvendelse.

The glycome, et begreb opfundet analogt med genomet og proteomet, henviser til alle saccharidstrukturer i en organisme. For fuldt ud at forstå de mangfoldige funktioner glycosylering vil kræve en integreret tilgang, der omfatter både funktionelle og strukturelle glycomics undersøgelser. Begge er kompliceret af ikke-template drevne karakter glycan-biosyntese, den resulterende komplekse og forskelligartede glycan strukturer, den hyppige inddragelse af aglycon struktur i modulering glycan ligand-receptor-vekselvirkninger på molekylært niveau, og den funktionelle betydning af lav hyppighed ligander. Det er almindeligt accepteret, at massespektrometri (MS) er en uundværlig metode for strukturelle glycomics undersøgelser, især for at identificere og karakterisere lav hyppighed ligander. At observere glycans eller glycokonjugater som molekylarter, bruger vi ofte en meget effektiv, lavt energiforbrug ioniseringsmetode, kaldet elektrospray (ESI). For mere itfejlede karakterisering af glycan struktur, er det vigtigt at vælge enkelte molekylarter og bryde glycaner i mindre stykker. Dette gøres normalt ved kollision-induceret dissociation, som involverer aktivering af glycans gennem kollision med inert gas molekyler. Den øgede energi inducerer obligation brud, og systematisk analyse af de resulterende fragmenter indeholder oplysninger om den molekylære struktur af glycan. Ofte kan &quot;signatur&quot;-fragmenter genereres der er diagnostiske for særlige glycan strukturelle træk. Sammen med den molekylære masse, kan disse fragmenter undertiden være tilstrækkelig til at identificere glycans, men tidligere meget mere information er nødvendig for fuldt ud at karakterisere dem, især hvis strukturen er hidtil ukendt. Disse fremgangsmåder indbefatter sukker præparat analyse, gaskromatografi-massespektrometri-analyse af delvist methylerede alditolacetater til bindingsanalyse, og specifikke glykosidase fordøjelse 17. 18-19, flere runder af lavenergi fragmentering, der effektivt kan gennemføres i et ion-trap-massespektrometer (IT-MS), i høj grad forbedrer information udbytte af glycan massespektralanalyse . Med fire eller fem runder af fragmentering (som ikke kan gøres med andre MS instrumenter), er det muligt at skelne isomere glycaner, der indeholder de samme sukkerkomponenter arrangeret i forskellige sukkerbindinger, selv om de er til stede sammen i blandinger af komponenter med samme molekylmasse (isobarer). I denne analyse var glycans derivatiseret, erstatte alle frie hydroxylgrupper med methylgrupper hjælp permethylering. Mens strukturel overdragelse af glycaner er mulig uden permethylering, at permethylering øger følsomheden 17. Levery og Zhou, har kombineret alle de potentielle fordele ved IT-MS metode, herunder afsløring af isomere structures hjælp signatur diagnostiske ioner, iagttages kun i MS 4 og MS 5 spektre, for meget følsom identifikation og kvantificering af glycosphingolipider stede i form af flere isobar blandinger 7-9. I teorien kan vi være i stand til at identificere alle eksisterende glycolipid struktur, indtil der foreligger standardiserede glycolipider, som kan være kemisk syntetiserede. De kritiske trin i denne analyse er genfindingsprocenten for GSL&#39;er fra biologiske prøver. Typisk 80 ug af GSL kan udvindes fra 100 millioner tumorceller såsom RBL. At frembringe tilstrækkelige molekylioner for multiple runder af fragmentering i ion-trap-massespektrometre er mindst 10 mikrogram tumor GSL&#39;er påkrævet. Lavt udbytte af GSL&#39;er under oprensning vil føre til lav overflod af ioner, som ikke kunne foretages en yderligere opsplitning. Succesen af ​​analysen afhænger af mængden af ​​GSL&#39;er, som udvindes. Typisk slutkoncentrationentration af permethylerede GSL&#39;er skal være 1 mg / ml, opløst i methanol, før de analyseres på en nano-elektrospray kilde. Grænsen for en grundig MS n analyse er afhængig af den overflod af specifik ion i MS 1 profil. En typisk e 7 ion overflod er nødvendige for en grundig MS 5 analyse. Det lave udbytte af GSL&#39;er under oprensning kan skyldes tab af GSL&#39;er under peracetylering trin (som fjerner phospholipiderne), når de per-acetylerede GSL&#39;er skal være bundet til Florisil resin chromatografisøjle, vasket, og derefter elueret. At sikre bindingen af ​​per-acetylerede GSL&#39;er til silicagel, skal prøver genindlæses to gange til kromatografisøjlen efter at være strømmet igennem.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2 Dichloroethane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34872</td>
 <td>Carcinogenic </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>VMR</td>
 <td>JT9524-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic anhydride</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>45830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A18P-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C606-1 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE Sephadex A25 (Cl Form)</td>
 <td>GE Healthcare Biosciences</td>
 <td>AB 17&mdash;170-01 </td>
 <td>100 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane (anhydrous): </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>457116 </td>
 <td>100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichloroacetic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D54702 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis cassette </td>
 <td>Fischer(Pierce) </td>
 <td>66110 </td>
 <td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>20684 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl acetate </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>UN1173 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Florisil</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>46384 </td>
 <td>for packing chromatography column</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hexanes </td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0290-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodomethane </td>
 <td>Riedel de Haen, Germany</td>
 <td>03810 </td>
 <td>stabilized with silver foil Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol </td>
 <td>VWR/EMD</td>
 <td>MXO475-1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral glycosphingolipid Qualmix </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1505</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monosialganglioside mixture</td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1508</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disialoganglioside mixture </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1509</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lactosyl ceramide and sialosylderivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1511</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyridine: </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>270407 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide: </td>
 <td>BDH </td>
 <td>0292 </td>
 <td>500 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium methoxide </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>404367 </td>
 <td>0.5 M solution in methanol</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Toluene </td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>9351-03 </td>
 <td>4 L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Name of the equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber glass (glass wool)</td>
 <td>Corning Incorporated</td>
 <td>3950 </td>
 <td>Pyrex 9989 glass</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm glass tubes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-962-10B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calibrated pipettes (100 microlitter)</td>
 <td>VMR</td>
 <td>53432-921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-961-29 </td>
 <td>With screw caps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Caps for glass tubes</td>
 <td>Kimble</td>
 <td>40566C </td>
 <td>size/13-415 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Merck TLC plates</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 29, 301-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tank for TLC</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 12,619-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps </td>
 <td>Drummond scientific company</td>
 <td>1-000-0100 </td>
 <td>10 &mu;l, for loading of TLC samples</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sunrise Microplate Absorbance Reader</td>
 <td>Tecan</td>
 <td>A-5082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Whatman Chromatography Paper</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>05-716-3E</td>
 <td>18 cm x 34 cm For TLC Tank</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Orcinol ferric chloride spray reagent</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>O7875</td>
 <td>For detecting glycosphingolipids on TLC plates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Prevel Spray Unit</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 36,555-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sonicator</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>Legend RT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Speedvac</td>
 <td>Savant</td>
 <td>AS160 </td>
 <td>With chemical trap for organic solvants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF-TOF Mass spectrometer</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Proteomics 4700 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ion Trap Mass spectrometer</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>LTQ </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens

Glycosphingolipider (GSL s) tilhører det glycokonjugatet klasse af biomakromolekyler, der bærer strukturel information for signifikante biologiske processer såsom embryonisk udvikling, signaltransduktion, og immun receptorgenkendelse 1-2. De indeholder komplekse sukkergrupper i form af isomerer, og lipiddele med variationer herunder fedtacyl kædelængde, umættethed og hydroxylering. Både carbohydrat og ceramid dele kan være grundlag for biologisk betydning. For eksempel indbefatter tri-hexosylceramides globotriaosylceramid (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) og isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), som har identiske molekylmasser men distinkte sukkerbindinger af kulhydratdelen, der er ansvarlig for fuldstændig forskellige biologiske funktioner 3-4. I et andet eksempel er det blevet vist, at modifikation af ceramid del af a-galactosylceramid, er en potent agonist ligand for invariant NKT-celler, ændringer deres cytokinsekretion profiler og funktion i dyremodeller for cancer og autoimmune sygdomme 5. Vanskeligheden ved at udføre en strukturel analyse af isomerer i immune organer og celler tjener som en barriere til bestemmelse af mange biologiske funktioner 6. Her præsenteres en visualiseret version af en fremgangsmåde til relativt enkel, hurtig og følsom analyse af glycosphingolipid profiler i immunceller 7-9. Denne metode er baseret på ekstraktion og kemisk modifikation (permethylering, se nedenfor figur 5A, blev alle OH-grupper hexose erstattet af MeO efter permethylering reaktion) af glycosphingolipider 10-15, efterfulgt af efterfølgende analyse under anvendelse af matrix-assisteret laser desorption / ionisering time- of-flight massespektrometri (MALDI-TOF/MS) og ion-trap massespektrometri. Denne metode kræver 50000000 immunceller for en fuldstændig analyse. Forsøgene kan gennemføres inden for en uge. Den relative forekomst af de forskellige glycosphingolipider kan være afgrænset ved sammenligning med syntetiske standarder. Denne metode har en følsomhed til at måle 1% iGb3 blandt Gb3 isomerer, hvor 2 fmol af total iGb3/Gb3 blanding er til stede 9. Ion trap massespektrometri, kan anvendes til at analysere isomerer. For eksempel, for at analysere tilstedeværelsen af globotriaosylceramid og isoglobtriaosylceramide i den samme prøve kan man anvende fragmenteringen af glycosphingolipid molekyler til strukturelt skelne mellem de to (jf. nedenfor figur 5). Desuden kemisk modifikation af sukkergrupper (gennem en permethylering reaktion) forbedrer ionisering og fragmentering effektivitetsgevinster for højere følsomhed og specificitet, og øger stabiliteten af ​​sialinsyrerester. Udvinding og kemisk modifikation af glycosphingolipider kan udføres i en klassisk certificeret kemisk hætte, og massespektrometri kan udføres ved corefaciliteter med ionfælde MS instrumenter.

Et eksempel på en MALDI MS-analyse af glycosphingolipider fra rotte-leukæmicellelinie RBL (en antigenpræsenterende celle type, der præsenterer glycosphingolipid antigener til NKT-celler) er vist i figur 3.. Ionerne kan tildeles til specifikke glycosphingolipid strukturer (figur 3A). I RBL-celler behandlet med NB-DGJ 16, et lægemiddel, som inhiberer glycosphingolipid syntese, væsentlig reduktion af alle glycosphingolipider blev observeret (figur 3B). Strukturelle isomerer kan ikke skelnes. MS / MS kapacitet Applied Biosystems 4700 tillader fragmentering af MS1 ioner til MS 2 fragmenter, der tillader begrænset strukturel information der skal genereres. Imidlertid MS2 analyse er ofte ikke tilstrækkelig til at diskriminere oligosaccharid isomerer. Ion-Trap MS-analyse af glycosphingolipider muliggør studiet af isomerer, såsom iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) og Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer), der kan eksistere som de trihexosylceramide ioner påvist i figur 3A. At detektere sådanne isomerer, blev standard iGb3 og Gb3 analyseret ved flere runder af fragmentering, indtil forskelle blev fundet (figur 4A og 4B). I eksemplet præsenteres her (figur 5C) iGb3 og Gb3 kunne blive diskrimineret ved at sammenligne med standard iGb3 og Gb3. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Figur 1. Rutediagram over glycosphingolipid ekstraktionsprocedure, og kemisk modificering af glycosphingolipider (permethylering). Glycosphingolipider blev ekstraheret fra celler med organiske opløsningsmidler. At fjerne ikke-glycosphingolipider, kan lipider være peracetyleret og deacetyleret. For det andet blev glycosphingolipider kemisk modificeret ved en permethylering reaktion, hvilket forbedrer følsomheden og specificiteten af ​​MS detection. Endelig blev glycosphingolipid profiler bestemt under anvendelse af MALDI-TOF-massespektrometri og ion trap massespektrometri. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Figur 2. Glycosphingolipid Kvantificering af Orcinol svovlsyre: Kvantificering af glycosphingolipider med en 0,2% Orcinol i 50% svovlsyreopløsning og en Glucose Standard Curve. <img alt="Figur 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Figur 3. Glycosphingolipidomics af rotte-leukæmiceller A. repræsentant MALDI massespektrum. Hver ion repræsenterer en specifik glycosphingolipid struktur, kan strukturelle isomerer ikke skelnes B. NB-DGJ, et stof, der hæmmer glycosphingolipid syntese, s.ignificantly reducerer alle glycosphingolipider produceret i RBL-celler. <img alt="Figur 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Figur 4. Tandem-massespektrometri af isomerer af glycosphingolipider. A. Karakteristiske nedbrydningsprodukter veje for positiv mode ionfælde massespektrometri af permethylerede GSL&#39;er DK 3 Cer og IGB 3 Cer. DK 3 og IGB 3 er tydeligt adskilt fra deres fragmentering mønstre. Forskellene i binding afspejles i de MS 4 produkt-ioner overensstemmelse med de isobar m / z 445 prækursorer. B. Repræsentative resultater, der viser iGb3 kan måles i en blanding af iGb3/Gb3 isomerer. Stjerner angiver diagnostiske ioner til iGb3 kun. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at</a>se større figur. <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Figur 5. Ion fælde MS tillader analyse af isomerer af glycosphingolipider. A. Standard iGb3 og Gb3 show forskel for fragmentering profil efter 4 runder af fragmentering i en ion fælde LTQ massespektrometer. B. Karakteristik MS 4 profil af ioner stammer fra iGb3 eller Gb3. C. Trihexosyleramides er blandinger af iGb3 og Gb3 isomerer, som kan identificeres ved ionfælde MS metode (figur af Dapeng Zhou). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens at JoVE.com

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

En specifik og følsom metode til at få indsigt i udtrykket profil glycosphingolipid antigener i immune organer og celler er beskrevet. Fremgangsmåden drager fordel af den ion-trap massespektrometri tillader trinvis fragmentering af glycosphingolipid molekyler til strukturel analyse i sammenligning med kemisk syntetiserede standarder.

Massespektrometrisk analyse af glycosphingolipid antigener

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener Beskyttet Funktionelle røde blodlegemer ved The Membrane podning af Compact hyperforgrenet Polyglyceroler

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Udvikling af et antigen-drevet Colitis Model at studere Præsentation af antigener ved antigen-præsenterende celler for T-celler

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Brug røntgenkrystallografi, Biofysik, og funktionelle assays til Bestem Mekanismer Governing T-celle receptor Anerkendelse af kræft antigener

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Rensning af membran til kabinen for endoplasmatiske Reticulum-associerede nedbrydning af eksogene antigener i Cross-præsentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Udtryk af eksogene antigener i Mycobacterium bovis BCG Vaccine via ikke-genetiske overflade dekoration med begærlighed-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fri ordning for masseproduktion af Murine naturlige dræberceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Enkelt-celle analyse af Immunophenotype og cytokin produktion i perifere blod via masse flowcytometri

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Spore Adsorption som et Nonrecombinant displaysystem for enzymer og antigener

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

Identifikation af Nukleolarfaktorer under HIV-1-replikation gennem rev-Immunopræcipitation og massespektrometri

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...