Name: mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00
Duration: 13 min 9 s
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1。ラボの安全性の懸念<ol><li>すべての有機溶媒は、明確なラベルを持つ特定の領域に格納する必要があります。必要な消火器のタイプのために製造して、ラベルを参照してください。 </li><li>使用されるいくつかの試薬は、潜在的に発がん性があると、精神的なうつ病を引き起こす可能性があります。これらの試薬は、換気との化学フード（具体的に特異的な試薬や機器の表を参照してください）​​で処理する必要があります。 </li><li>それは、有機溶剤や細胞を扱う場合、手袋、白衣、および眼の保護のような個人用保護具を常時利用することをお勧めします。 </li></ol> 2。ラット白血病細胞からスフィンゴ糖脂質の抽出<ol><li>店舗のRBLラット白血病細胞-80℃の条件下で16x100 mmガラス管中の8（10000000から100000000）。細胞は、トリパンブルー染色後に血球計算板でカウントされます。細胞の生存率は95％よりも高くなければならない。 </li><li>広範sonicatを使用して脂質を抽出イオン1〜2時間毎に混合極性溶媒との4倍。最初と最後の溶媒としてクロロホルム - メタノール1:1（v / v）の6ミリリットルを使用しています。イソプロパノールの六ミリリットル：ヘキサン：H 2 O 55:25:20（V / V / V、使用前に吸引して上相を除去）を、第2、第3の溶媒として使用することができる。ヘキサン：この溶媒はイソプロパノールを混合することにより調製される55:25:20の割合でH 2 Oを、積極的にそれを振って、削除されます表示される上相を、できるようになります。使用のための下相を保つ。 </li><li>ペレット不溶性物質を遠心分離して超音波処理に従ってください。上清をプール。 4時間Speed​​vacにそれらを乾燥させてください。 Speed​​vacが使用できない場合、窒素気流またはロータリーエバポレーターを使用することができます。蒸発有機溶剤を保持するために優れたコールドトラップを使用します。真空ポンプ油への有機溶媒の汚染は、真空ポンプの効率が低下します。 </li><li>高性能薄層クロマトグラフィー（HPTLC）を使用して予備的な分析を実行します。糖脂質を定量化するために、、50％硫酸溶液（50ml中100mg）とガラクトース標準（100ミリリットル原液で40mg）を、0.2％オルシノールを準備します。 30μlの反応容積で標準曲線（g / Lの0〜20 g / lに）として使用する希釈系列を用意してください。各希釈系列試料にメタノール20μLを追加します。 、メタノール200μlの各糖脂質試料を溶かす超音波処理し、糖量測定のための20μlを使用しています。ねじ込むキャップ（ザルスタット、72.692.005）と1.5mlのエッペンドルフチューブに、標準曲線のために役立つガラクトース-H 2 O-メタノール溶液のシリーズでは、各サンプルを50％硫酸溶液中でオルシノール0.2％0.4ミリリットルを追加。 100℃の加熱ブロック中で5分間沸騰℃までテカンサンライズマイクロプレートリーダーを用いて440nmの呈色反応の光学濃度を読み取る。クロロホルム-メタノール1:1（v / v）で処理された中性脂質のための溶媒としてH 2 O 60:35:8（v / v / v）のメタノール：HPTLC実行するには、クロロホルムを使用しています。ヘキサン：H 2 O 55:25:20（v / v / v）のイソプロパノールを使用酸脂質（ガングリオシド）のための溶媒。隔離された中性糖脂質は、200μlのクロロホルムに溶解し、溶媒：メタノール1:1（v / v）とドラモンドMicrocapsによってMerckシリカゲル薄層クロマトグラフィープレート上にロードされます。プレートは、溶媒クロロホルムに実行されました：メタノール：H 2 O 60:35:8（v / v / v）を、乾燥させた。スフィンゴ糖脂質は、300℃オルシノール硫酸により可視化した℃の</li><li> DEAEセファデックスA-25の小さなカラムに陰イオン交換クロマトグラフィーによる中性および酸性脂質のうち、酸性脂質画分から中性脂質を分離するために、[DEAEセファデックスA25樹脂は、セファデックスA-25樹脂を浸漬することによって調製することができるクロロホルムで粉：メタノール：H 2 O 30:60:8（v / v / v）の一夜。デックスA25樹脂が残っているのになるまで上清を吸引します。メタノール：H 2 O 30:60:8（v / v / v）の樹脂を洗浄し、新鮮なクロロホルムを追加します。デックスA25樹脂]から負に荷電した残基を除去するために3回繰り返します。 </li><li>ディゾルブ（10個を超える分）超音波処理し、クロロホルムでステップ2.1から脂質を懸濁する：メタノール：必要に応じてH 2 O 30:60:8（v / v / v）を。 </li><li>グラスウールと9使用して小さなDEAEセファデックスA25（塩素フォーム）カラムを準備し、 &quot;パスツールピペットを。樹脂粉末がカラムを通過しないように慎重にグラスウールを梱包してください。にDEAEセファデックスA25（塩素フォーム）樹脂を追加する&quot;カラムが乾燥せずにパスツールピペット &quot;9の&quot;首。あなたは溶離液に樹脂が表示されないことを確認してください。クロロホルムに溶解したサンプル：メタノール：H 2 O 30:60:8（V / V / V）を溶解させた。中性脂質画分には、小数部を通って流れている。 </li><li>メタノール中の酢酸ナトリウム8mlで酸性脂質画分（樹脂にバインドされている）溶出します。両方中性および酸性画分を乾燥し、透析によってそれらを脱塩、Speed​​vacことによって、それらを乾燥させ、HPTLCによってそれらを分析。 </li></ol>酸性画分は、直接ステップ3の反応のため透析できガングリオシドが含まれています。中性画分には、アセチル化反応によって除去しなければならない中性スフィンゴ糖脂質だけでなく、リン脂質（ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン）だけでなく、含まれています。 我々の経験では、透析カセットの方法は、透析チューブまたは逆相C18カラムクロマトグラフィーよりも効率的で便利です。 <ol start="9"><li>次のステップは、アセチル化と過アセチル化反応によって中性スフィンゴ糖脂質からリン脂質を除去することである。 DEAEセファデックスA-25に、パススルーSpeed​​vacの小数（冷房付き）で4時間乾燥させてください。サンプルは乾燥していたら、別の4時間Speed​​vacとドライにそれらを戻す。任意の残留水が過アセチル化反応を防止するように、これらのサンプルは完全に乾燥していることを確認します。 </li><li>ピリジン1mlと室温または37℃で一晩、暗闇の中で無水酢酸0.5mlのサンプルをPeracetylate。ピリジンと無水酢酸の量はアップするために適切であるスフィンゴ糖脂質の200μgまで。スフィンゴ糖脂質は、良好な溶解性を持っているように、この反応は、37℃で行うことができる。 </li><li>完全に蒸発を確保するためにトルエン3倍の1ミリリットル（共蒸着）を添加し、3時間Speed​​vacによって過アセチル化物質を乾燥させます。サンプルは乾燥するまでまだSpeed​​vac、完全に乾燥していない場合。 </li><li>フロリジルビーズを用いて、ガラスウールをパスツールピペットでフロリジル（Sigma-Aldrich）をカラム（30〜60メッシュ、10×80 mm）を用意します。フロリジルビーズが完全に110℃のオーブン中でインキュベーションすることにより、使用前に乾燥させる必要があります。首にパスツールピペットにビーズをいっぱいに、1,2 - ジクロロエタン、ヘキサン4:1（v / v）に平衡化します。 </li></ol>フロリジルカラムからの溶出は非常に高速です。溶剤の急激なボラティリティがカラムの乾燥につながることができます。したがって、すべての溶媒混合物は、それが溶出時に列を停止することはできませんので、列を実行する前に準備する必要があります。 <ol start="13"><li> peracetylを適用1 1,2 - ジクロロエタン-ヘキサン4:1（v / v）のミリリットル、1,2 - ジクロロエタン10mlを、続いて同じ溶剤の6ミリリットルでカラムを洗浄でatedサンプル。 1,2 - ジクロロエタン - アセトン1:1（v / v）の6ミリリットルで中性過アセチル化糖脂質を溶出する。過アセチル化リンがいない間過アセチル化スフィンゴ糖脂質は、フロリジルカラムにバインドするため、この手順は、グリコから過アセチル化リン脂質を除去します。 </li><li> 2ミリリットルの0.5 Mナトリウムメトキシドで2時間と脱アセチル化のためSpeed​​vacによって分画を乾燥[Sigma-Aldrich社、403067]室温で3時間メタノール2mlインチ</li><li>メタノール酢酸3ml透析によるSpeed​​vac、脱塩によるもの[酢酸/メタノール85分の15 v / v]の、乾燥した[水3mlの乾燥品を溶解し、スライドインアナライザに注入して混合物を中和透析カセットは、24時間、水に対して透析する。少なくとも2回水を変更する]。サンプルが完全に乾くまでSpeed​​vacで透析したスフィンゴ糖脂質（水溶液中で）乾燥させます。 </li&gt; </ol> 3。スフィンゴ糖脂質13の化学修飾（Permethylation） <ol><li>スクリューキャップとテフロンライナー付きガラス管にスフィンゴ糖脂質（1〜20μg）を導入し、特殊な乾燥条件または不活性ガス雰囲気を使用せずに、ジメチルスルホキシド（150μL）を追加します。 </li><li>乳棒と化学モルタルでそれらを粉砕することにより水酸化ナトリウム粒子から粉末水酸化ナトリウム（40-60 mg）を準備します。非常に乾燥した環境で粉体を保存して、粉末の吸入を避けるために、化学フード内で研削を行うように注意していることを確認してください。 </li><li>次にへらで試料溶液に水酸化ナトリウムの粉末を追加します。 100マイクロシリンジHalmiltonとヨードメタン（80μL）を加える[またはピペットはゴムチューブを介してシリンジにリンクされて校正された100マイクロリットルVWRを使用することができます]と、1時間室温で混合物を横に振る。 </li><li>水（2mL）でメチル化反応をクエンチ。 3倍過メチル化生成物を抽出ジクロロメタンを加えて（2ミリリットル）は[糖脂質が低い段階であるジクロロメタン相であるので、上相を新しいガラス管に転送することができますし、ジクロロメタンで再度抽出]。 </li><li>合わせたジクロロメタンは、[、水で上相、その後に処分することができる] 2 mlの水で3回抽出し、洗浄します。最後の洗浄の後、新しいチューブにサンプルを転送し、Speed​​vacを使用して乾燥させます。 </li><li>次いで、試料をESI-MS分析用メタノールの100から200μlに溶解させることができる。 </li></ol> 4。パーメチルGycosphingolipidsのMALDI-TOF解析<ol><li> MALDI TOF-TOF型質量分析装置（アプライドバイオシステムズ4700、Foster City、CA）を上に、MALDI-TOF-MSとMALDI-TOF/TOF-MS/MS実験を行った。 10 mg / mlのジヒドロキシ安息香酸（DHB）のアセトニトリルと水で0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）の50％の体積の50％の体積を混合することにより行列を準備します。 </li><li> DHBマトリックスをMALDIタージェに発見することができますメタノールに溶解した試料を1μl（100ngの糖脂質を含む）スポット続いトン（1μl）を、。徐々に適用され、それが分析する前に乾燥することができます。 </li></ol> 5。パーメチル化スフィンゴ糖脂質のイオントラップMS分析<ol><li> 30から50パーセントの衝突エネルギーと正イオンモードで℃のキャピラリー温度230℃で0.30μL/ minの流量、ナノエレクトロスプレー源を用いた線形イオントラップ質量分析計（LTQ、ThermoScientific、サンノゼ、カリフォルニア州）で質量分析を行う。プリカーサイオンの微小残存豊かさを残すために衝突エネルギーを設定します。ナトリウム付加物等の全てのイオンを検出します。 </li><li>糖鎖フラグメントのm / z 667および末端二糖1を介しsodiated分子イオンからMS 4プロダクトイオンの異なるパターンを比較することにより、Gb3の（Galα4Galβ4Glcβ1Cer）とiGb3（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）規格の重体混合物中iGb3（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）を識別する-エンイオンm / z 445（ すなわちX→667→445→、X過メチルGb3の（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）のものと、ESI-LIT-MSを介して純粋な過メチルiGb3（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）標準のMS 1）で検出された分子イオンを意味します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+Glycosphingolipids.">Chapter 10 Glycosphingolipids.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Bendelac, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17+NKT+cells+and+other+Innate-like+T+and+B+lineages.">Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages.</a> Fundamental Immunology. , (2011).</li><li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+shigella+diarrhea.+XI.+Isolation+of+a+shigella+toxin-binding+glycolipid+from+rabbit+jejunum+and+HeLa+cells+and+its+identification+as+globotriaosylceramide.">Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide.</a> J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).</li><li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+function+of+iGb3.">The immunological function of iGb3.</a> Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).</li><li>Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+glycolipid+prevents+autoimmune+encephalomyelitis+by+inducing+TH2+bias+of+natural+killer+T+cells.">A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells.</a> Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).</li><li>Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mapping+of+glycomes:+implications+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).</li><li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus.">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li><li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+quantitation+of+isoglobotriaosylceramide+in+the+presence+of+isobaric+components+using+electrospray+ionization-ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).</li><li>Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+isoglobo+and+globo+series+tetraglycosylceramides+in+human+thymus+by+ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).</li><li>Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+permethylation+of+glycolipid,+and+polysaccharide+catalyzed+by+methylsulfonyl+carbanion+in+dimethyl+sulfoxide.">A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide.</a> J. Biochem. (Tokyo). 55, 205 (1964).</li><li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simultaneous+methylation+of+fatty+and+hydroxy+fatty+acids+for+gas-liquid+chromatographic+analysis.">Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis.</a> Carbohydr. Res. 131, 209 (1984).</li><li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li><li>Levery, S. B., Hakomori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+methylation+analysis+of+glycolipids+using+capillary+gas+chromatography-chemical+ionization+mass+fragmentography+with+selected+ion+monitoring.">Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring.</a> Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).</li><li>Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+polyfucosylated+lactosaminoglycan+from+human+granulocytes.">Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).</li><li>Ciucanu, I., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oxidative+degradation+during+the+per-O-methylation+of+carbohydrates.">Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 16213 (2003).</li><li>Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-butyldeoxygalactonojirimycin+inhibits+glycolipid+biosynthesis+but+does+not+affect+N-linked+oligosaccharide+processing.">N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.</a> J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).</li><li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47+Structural+Analysis+of+Glycans.">Chapter 47 Structural Analysis of Glycans.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib:+an+MSn+spectral+library.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li></ol>

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グライコーム、ゲノムとプロテオームと同様に作られた言葉は、生物のすべての糖構造を指す。完全にグリコシル化のマニホールドの機能を理解するために、両方の機能と構造グライコミクス研究を含む統合的なアプローチが必要になります。どちらも、糖鎖の生合成、糖鎖構造の結果として生じる複雑さと多様性、分子レベルで調節する糖鎖リガンドとレセプターの相互作用のアグリコン構造の頻繁な関与、および低濃度のリガンドの機能的重要性の非テンプレート駆動型の性質によって複雑化されています。 これは、一般的に質量分析（MS）は、特に低濃度のリガンドを同定および特徴付けるために、構造グライコミクス研究のために必要不可欠な方法であることが認められている。分子種としての糖鎖または糖質を観察するために、私たちはしばしば、エレクトロスプレーイオン化（ESI）と呼ばれる高効率、低エネルギーイオン化法を使用します。もっとDET用グリカン構造のキャラクタリゼーションailed、それは個々の分子種を選択して、より小さな部分に糖鎖を断ち切ることが不可欠である。これは通常、不活性ガス分子と衝突して、糖鎖を活性伴う衝突誘起解離によって行われます。増大したエネルギーは、債券の破損を誘発し、得られた断片の体系的な分析では、糖鎖の分子構造に関する情報を提供します。多くの場合、 &quot;署名&quot;の断片は、特定の糖鎖構造の機能の診断であることを生成することができます。一緒に分子量を有する、これらの断片は、その構造が新規である場合は特に、時には糖鎖を識別するために十分なことができますが、過去に多くの情報を完全にそれらを特徴づけるために必要とされてきた。これらのメソッドは、糖組成分析、連鎖解析のために部分的にメチル化アルジトールアセテートのガスクロマトグラフィー質量分析、および特定のグリコシダーゼ消化17を含む。 18から19を介して実証し、効果的にイオントラップ型質量分析計（IT-MS）の中で実施することができる低エネルギーの断片化のため、複数のラウンドでは、大幅に糖鎖質量スペクトル分析からの情報収率を向上させる。断片化（他のMS機器を使って行うことができない）の4または5ラウンドで、これらは同じで成分の混合物中に一緒に存在している場合でも、異なる糖結合に配置された同一の糖成分が含まれている異性体糖鎖を区別することが可能である分子量（等圧線）。この分析では、糖鎖はpermethylationを使用してメチル基を持つすべての遊離ヒドロキシル基を置き換えて、誘導体化した。糖鎖構造の割り当てがpermethylationなしで可能ですが、permethylationは感度17を増加させます。 LeveryとZhouは、異性STRUの検出など、IT-MSの方法論の潜在的な利点のすべてを組み合わせている7月9日 、複数の同重体の混合物の形で存在するスフィンゴ糖脂質の高感度同定および定量のためのMSとMS 4 5スペクトルにおいてのみ観察署名診断イオンを用いctures。理論的には、化学的に合成することができる標準的な糖脂質の可用性保留中、すべての既存の糖脂質構造を識別することができるかもしれません。 この分析の重要なステップは、生体サンプルから糖脂質の回収率である。 GSLの典型的には80μgのは、RBLなど億腫瘍細胞から回収することができる。イオントラップ型質量分析計内の断片化の複数のラウンドのための十分な分子イオンを生成するには、腫瘍GSLの少なくとも10マイクログラムが必要です。精製中脂質の収率が低い、さらに断片化に供することができなかったイオンの低い存在につながる。解析の成功は、回収される脂質の量に依存します。一般的に、最終濃度完全メチル化糖脂質のentrationは、ナノエレクトロスプレーイオン源で分析される前に、メタノールに溶解した1 mg / mlとを、到達する必要があります。徹底したMS n分析の限界は、MS 1プロファイル内の特定のイオンの存在量に依存しています。一般的なe 7イオンの存在量は、徹底したMSの5分析のために必要とされる。精製中脂質の収率が低いは、per-アセチル化糖脂質は、フロリジル樹脂クロマトグラフィーカラムにバインドされて洗浄し、その後に溶出されている必要があり、過アセチル化ステップの間GSLの損失（リン脂質を除去する）が原因で発生することができます。シリカゲルにあたりアセチル化糖脂質の結合を確保するために、試料を流れる後にクロマトグラフィーカラムに二回リロードする必要があります。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2 Dichloroethane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34872</td>
 <td>Carcinogenic </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>VMR</td>
 <td>JT9524-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic anhydride</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>45830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A18P-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C606-1 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE Sephadex A25 (Cl Form)</td>
 <td>GE Healthcare Biosciences</td>
 <td>AB 17&mdash;170-01 </td>
 <td>100 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane (anhydrous): </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>457116 </td>
 <td>100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichloroacetic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D54702 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis cassette </td>
 <td>Fischer(Pierce) </td>
 <td>66110 </td>
 <td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>20684 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl acetate </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>UN1173 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Florisil</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>46384 </td>
 <td>for packing chromatography column</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hexanes </td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0290-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodomethane </td>
 <td>Riedel de Haen, Germany</td>
 <td>03810 </td>
 <td>stabilized with silver foil Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol </td>
 <td>VWR/EMD</td>
 <td>MXO475-1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral glycosphingolipid Qualmix </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1505</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monosialganglioside mixture</td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1508</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disialoganglioside mixture </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1509</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lactosyl ceramide and sialosylderivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1511</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyridine: </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>270407 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide: </td>
 <td>BDH </td>
 <td>0292 </td>
 <td>500 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium methoxide </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>404367 </td>
 <td>0.5 M solution in methanol</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Toluene </td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>9351-03 </td>
 <td>4 L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Name of the equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber glass (glass wool)</td>
 <td>Corning Incorporated</td>
 <td>3950 </td>
 <td>Pyrex 9989 glass</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm glass tubes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-962-10B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calibrated pipettes (100 microlitter)</td>
 <td>VMR</td>
 <td>53432-921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-961-29 </td>
 <td>With screw caps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Caps for glass tubes</td>
 <td>Kimble</td>
 <td>40566C </td>
 <td>size/13-415 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Merck TLC plates</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 29, 301-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tank for TLC</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 12,619-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps </td>
 <td>Drummond scientific company</td>
 <td>1-000-0100 </td>
 <td>10 &mu;l, for loading of TLC samples</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sunrise Microplate Absorbance Reader</td>
 <td>Tecan</td>
 <td>A-5082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Whatman Chromatography Paper</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>05-716-3E</td>
 <td>18 cm x 34 cm For TLC Tank</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Orcinol ferric chloride spray reagent</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>O7875</td>
 <td>For detecting glycosphingolipids on TLC plates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Prevel Spray Unit</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 36,555-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sonicator</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>Legend RT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Speedvac</td>
 <td>Savant</td>
 <td>AS160 </td>
 <td>With chemical trap for organic solvants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF-TOF Mass spectrometer</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Proteomics 4700 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ion Trap Mass spectrometer</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>LTQ </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens

スフィンゴ糖脂質（GSLの）は、胚発生、シグナル伝達、免疫受容体認識1-2など重要な生物学的プロセスの構造情報を負担生体高分子、複合糖質のクラスに属する。彼らは複雑な異性体の形で糖部分、および脂肪アシル鎖長、不飽和、および水酸化含むバリエーションを持つ脂質部分を含んでいます。炭水化物とセラミド部分の両方は、生物学的意義の基礎となると考えられる。例えば、トライhexosylceramidesは、同一分子量が、3月4日完全に異なる生物学的機能を担う糖鎖部分の異なる糖結合を持つグロボトリアオシルセラミド（Galα4Galβ4Glcβ1Cer）とisoglobotriaosylceramide（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）が含まれます。別の例では、α-ガラクトシルセラミドの一部の変更、不変のための強力なアゴニストリガンドが実証されているアリNKT細胞、がんや自己免疫疾患5の動物モデルにおける変化、そのサイトカイン分泌プロファイルと機能を。免疫臓器や細胞での異性体の構造解析を行うには困難が6多くの生物学的機能を決定するためのバリアとして機能します。 ここでは、7月9日免疫細胞におけるスフィンゴ糖脂質プロファイルの比較的簡単、迅速、かつ高感度な分析法の可視化バージョンを提示します。このメソッドは、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化を使用して、その後の分析に続いスフィンゴ糖10-15の抽出と化学修飾（permethylationは、 図5A以下を参照、ヘキソースのすべてのOH基がpermethylation反応後MEOに取って代わられた）に基づいている時間をの飛行質量分析（MALDI-TOF/MS）とイオントラップ質量分析。この方法は、完全な分析のための5000万免疫細胞を必要とします。実験は1週間以内に完了することができます。さまざまなスフィンゴ糖脂質の相対量は、合成標準規格との比較によって線引きすることができます。この方法は、Gb3の異性体、合計iGb3/Gb3混合物が存在している9の2 fmolの間で1パーセントiGb3の測定感度を持っています。 イオントラップ質量分析法は、異性体の分析に使用できます。例えば、同じ試料中グロボトリアオシルセラミドとisoglobtriaosylceramideの存在を分析するために、一つは構造的に2（ 図5下記参照）を区別するスフィンゴ糖脂質分子のフラグメンテーションを使用することができます。さらに、糖部分の化学修飾は、（permethylation反応を介して）より高い感度と特異性のためにイオン化し、断片化の効率を向上し、シアル酸残基の安定性を高めます。スフィンゴ糖脂質の抽出や化学修飾は、古典的な認定化学フード内で行うことができ、質量分析法は、コアによって行うことができるイオントラップMS機器と設備を備えています。

ラット白血病細胞株RBL（NKT細胞にスフィンゴ糖脂質抗原を提示する抗原提示細胞型）のスフィンゴ糖脂質のMALDI MS分析の例を図3に示します。イオンは特定のスフィンゴ糖脂質の構造（ 図3A）に割り当てることができます。 NB-DGJ 16、スフィンゴ糖脂質合成を阻害する薬剤によって治療RBL細胞では、すべてのスフィンゴ糖脂質の有意な減少が（ 図3B）が観察された。構造異性体を区​​別することはできません。アプライドバイオシステムズ4700のMS / MSの容量が限られた構造情報を生成することができるように、MS2フラグメントにMS1イオンの断片化を可能にします。しかし、MS2分析はしばしばオリゴ糖の異性体を区​​別するために十分ではありません。 スフィンゴ糖脂質のイオントラップMS分析は、そのようなiGb3（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）とGb3の（Galαとして、異性体の研究を可能にする図3Aに検出されたトリヘキソシルセラミドイオンとして存在することができる4Galβ4Glcβ1Cer）。違いは（ 図4Aおよび4B）発見されたまで、このような異性体を検出するために、標準iGb3とGb3のは、断片化の複数のラウンドで分析した。ここで紹介する例では（ 図5C）iGb3とGb3のは標準iGb3とGb3のに比較することによって識別することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> 図1。スフィンゴ糖脂質の抽出手順を示すフローチャートであり、スフィンゴ糖脂質の化学修飾（permethylation）。スフィンゴ糖脂質は有機溶媒により細胞から抽出された。非スフィンゴ糖脂質を除去するには、脂質が過アセチル化と脱アセチル化することができます。第二に、スフィンゴ糖脂質は、化学的に、MS detectioの感度と特異性を向上させpermethylation反応により変更されたnである。最後に、スフィンゴ糖脂質プロファイルは、MALDI-TOF質量分析とイオントラップ質量分析法を用いて決定した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> 図2。オルシノール硫酸法で糖脂質定量化 ：50％硫酸溶液とグルコース標準曲線のオルシノール0.2％を使用したスフィンゴ糖脂質の定量。 <img alt="図3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> 図3。ラット白血病細胞のGlycosphingolipidomics A.代表MALDI質量スペクトル;。各イオンが特定のスフィンゴ糖脂質の構造を表し、構造異性体を区別することができませんBの NB-DGJ、スフィンゴ糖脂質の合成を阻害する薬剤は、s。ignificantly RBL細胞で生成されたすべてのスフィンゴ糖脂質を減らすことができます。 <img alt="図4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> 図4。スフィンゴ糖の異性体のタンデム質量分析。完全メチル化糖脂質のGb 3 CerおよびIGB 3 Cerのポジティブモードイオントラップ質量分析法のためのA.特性分解経路。 GB 3とigb 3は明らかに彼らのフラグメンテーションパターンで区切られています。リンケージの違いは重体のm / z 445の前駆体と一致してMSの4プロダクトイオンに反映されます。Bは 。 iGB3を示す代表的な結果をiGb3/Gb3異性体の混合物で測定することができます。スターだけiGb3ための診断イオンを示す。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">ここをクリックする</a>拡大図を表示します。 <img alt="図5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> 図5。イオントラップMSは、スフィンゴ糖の異性体の分析を行うことができます。A.標準iGb3とイオントラップLTQ質量分析計内の断片化の4ラウンド後に断片化プロファイルのGb3のショーの違い。iGb3またはGb3の℃から派生したイオンのBの特性、MS 4プロファイルTrihexosyleramidesは、イオントラップMS法（大鵬周によって図）で識別できiGb3とGb3の異性体の混合物である。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

免疫臓器や細胞内のスフィンゴ糖脂質抗原の発現プロファイルを洞察するための特異的かつ高感度の方法が記載されている。この方法は、化学的に合成された基準と比較して、構造解析のためのスフィンゴ糖脂質分子の段階的な断片化を許可するイオントラップ質量分析法を活用しています。

スフィンゴ糖脂質抗原の質量分析

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Research

JoVE Journal

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