Name: mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens at JoVE.com

DZ støttes av MD Anderson Cancer Center og NIH tilskudd AI079232. MD Anderson Cancer Center støttes delvis av NIH stipend CA16672.

1. Lab Safety Bekymringer <ol><li> Alle organiske løsemidler må lagres i bestemte områder med tydelig merking. Se etikettene ved produserer for typer brannslokkeapparater som kreves. </li><li> Flere reagenser brukes er potensielt kreftfremkallende, og kan føre til mental depresjon. Disse reagensene må håndteres i en kjemisk hette med ventilasjon (Se tabell over spesifikke reagenser og utstyr for detaljer). </li><li> Det anbefales at når du arbeider med organiske løsemidler og celler, personlig verneutstyr som hansker og frakk, og øyebeskyttelse utnyttes til enhver tid. </li></ol> 2. Utvinning av glykosfingolipider fra Rat leukemiceller <ol><li> Oppbevar RBL rotte leukemiceller 8 (fra 10 til 100 millioner) i 16x100 mm glassrør henhold -80 ° C vilkår. Celler telles av en hemocytometer etter trypan blå flekker. Levedyktighet av celler bør være høyere enn 95%. </li><li> Pakk lipider med omfattende sonication fire ganger for 1-2 timers hver med blandede polaritet løsemidler. Bruke 6 ml kloroform-metanol 1:1 (v / v) som den første og siste oppløsningsmiddel. Seks milliliter isopropanol: heksan: H 2 O 55:25:20 (v / v / v, fjerne øvre fase ved aspirasjon før bruk) kan deretter bli brukt som det andre og tredje oppløsningsmiddel. Dette løsemiddel er utarbeidet ved å blande isopropanol: heksan: H 2 O i en 55:25:20 ratio, riste den kraftig, og la en øvre fase skal vises, som vil bli fjernet. Hold lavere fase for bruk. </li><li> Følg sonikering med sentrifugering for å pelletere uoppløselig materiale. Pool supernatantene. Tørk dem i en Speedvac i 4 timer. Nitrogenstrøm eller rotasjonsfordamper kan brukes hvis Speedvac er utilgjengelig. Bruk en god kald felle å holde fordampet organiske løsemidler. Forurensning av organisk oppløsningsmiddel i vakuumpumpe oljen vil forringe effektiviteten av vakuumpumpen. </li><li> Utføre en foreløpig analyse ved hjelp av høy ytelse tynnsjiktkromatografi (HPTLC). Å kvantifisere glykolipider, Forberede en 0,2% orcinol i 50% svovelsyreløsning (100 mg i 50 ml) og en Galaktose standard (40 mg i 100 ml stamløsning). Forbered i 30 pl reaksjonsvolum en serie fortynninger til bruk som standard kurve (fra 0 g / L til 20 g / L). Tilsett 20 pl av metanol til hver fortynning serie prøve. Oppløs hver glycolipid prøve i 200 ul metanol, sonicate og bruke 20 ul for glykolipid kvantitet måling. I 1,5 ml Eppendorf-rør med innskrudde caps (Sarstedt, 72.692.005), tilsett 0,4 ml 0,2% orcinol i 50% svovelsyreoppløsning til hver prøve, med en serie av Galaktose-H 2 O-Metanol løsninger som tjener til standardkurve . Kok i 5 minutter i varmeblokk ved 100 ° C. Les optisk tetthet av farge reaksjon på 440 nm ved hjelp Sunrise Tecan Microplate Reader. Å utføre HPTLC, bruke kloroform: metanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) som løsningsmiddel for de nøytrale lipider som ble behandlet med kloroform-metanol 1:1 (v / v). Bruk isopropanol: heksan: H 2 O 55:25:20 (v / v / v) somløsningsmidlet for de sure lipider (gangliosider). De isolerte nøytrale GSLs ble oppløst i 200 pl oppløsningsmiddel kloroform: metanol 1:1 (v / v) og lastet på Merck silikagel tynnsjiktskromatografi platen ved Drummond microcaps. Platene ble kjørt i løsningsmiddel kloroform: metanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) og tørket. De glykosfingolipider ble visualisert ved orcinol-svovelsyre ved 300 ° C. </li><li> For å skille ut de nøytrale lipider fra de sure lipider, fraksjon ut de nøytrale og sure lipider anionbytte kromatografi på en liten kolonne av DEAE Sephadex A-25 [DEAE Sephadex A25 harpiks kan fremstilles ved bløtlegging Sephadex A-25 resin pulver i kloroform: metanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) over natten. Aspirer supernatanten til Sephadex A25 harpiksen er alt som er igjen. Legge til frisk kloroform: metanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) for å vaske harpiksen. Gjenta tre ganger for å fjerne de negativt ladede rester fra Sephadex A25 harpiks]. </li><li> Oppløse, Sonicate (for ikke mer enn 10 minutter), og resuspender lipidene fra trinn 2,1 i kloroform: metanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) når det er nødvendig. </li><li> Lage en liten DEAE Sephadex A25 (Cl Form) kolonne ved hjelp av glassull og en 9 &quot;Pasteur pipette. Pakk glassull nøye, slik at harpiks pulver ikke passerer gjennom kolonnen. Legg DEAE Sephadex A25 (Cl Form) harpiks til&quot; hals &quot;av 9&quot; Pasteur pipette uten å la søylen tørr. Pass på at du ikke ser noen harpiks i elueringsmiddel. Prøvene oppløst i kloroform: metanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) ble oppløst. Den nøytrale lipidfraksjonen er flyten gjennom fraksjon. </li><li> Eluer sure lipidfraksjonen (bundet til harpiksene) med 8 ml natriumacetat i metanol. Tørk både nøytrale og sure fraksjoner, avsalte dem ved dialyse, tørk dem med Speedvac og analysere dem ved HPTLC. </li></ol> Den sure fraksjonen inneholder gangliosider som kan dialyseres for trinnet 3 reaksjonen direkte.Den nøytrale fraksjon inneholder ikke bare nøytrale glykosfingolipider, men også fosfolipider (fosfatidylcholin og sphingomyelin), som må fjernes ved en acetylering reaksjon. I vår erfaring, metoden for en dialyse kassett, er mer effektiv og praktisk enn en dialyse tube eller reversfasekolonne C18 kolonnekromatografi. <ol start="9"><li> Det neste trinnet er fjerning av fosfolipider fra nøytrale glykosfingolipider av en acetylering og peracetylation reaksjon. Tørk DEAE Sephadex A-25 pass-through fraksjon i Speedvac (med avkjøling) i 4 timer. Etter at prøvene er tørre, legg dem tilbake i Speedvac og tørr for en annen 4 hr. Sørg for at disse prøvene er helt tørre, så eventuelle gjenværende vann vil hindre peracetylation reaksjon. </li><li> Peracetylate prøvene med 1 ml pyridin og 0,5 ml eddiksyreanhydrid i mørke ved romtemperatur eller 37 ° C over natten. Denne mengden av pyridin og eddiksyreanhydrid er riktig for opptil 200 mikrogram glykosfingolipider. Denne reaksjon kan utføres ved 37 ° C, da de GSLs har bedre oppløselighet. </li><li> Tørk peracetylated materiale ved Speedvac i 3 timer, med tilsetning av 1 ml toluen 3x (ko-avdamping) for å sikre fullstendig fordamping. Hvis prøvene er fortsatt ikke helt tørr, Speedvac til den er tørr. </li><li> Forberede en Florisil (Sigma-Aldrich) kolonne (30-60 mesh, 10 x 80 mm) i en Pasteur-pipette med glassull, hjelp Florisil perler. Florisil perler bør være fullstendig tørket før bruk, etter inkubasjon i en 110 ° C ovn. Fyll perlene inn Pasteur pipetten opp til halsen, og likevekt i 1,2-dikloretan-heksan 4:1 (v / v). </li></ol> Eluering fra Florisil kolonnen er svært rask. Rask volatilitet oppløsningsmidlene kan føre til kolonne tørking. Dermed alle løsemiddelblandinger bør fremstilles før kjøring kolonnen siden det ikke er mulig å stoppe kolonnen under eluering. <ol start="13"><li> Påfør peracetylrerte prøve i 1 ml 1,2-dikloretan-heksan 4:1 (v / v), og vaske kolonnen med 6 ml av det samme løsningsmiddel, etterfulgt av 10 ml av 1,2-dikloretan. Eluere nøytrale peracetylated GSLs med 6 ml av 1,2-dikloretan-aceton 1:1 (v / v). Dette trinnet fjerner peracetylated fosfolipider fra glykosfingolipider, fordi peracetylated glykosfingolipider bindes til Florisil kolonne, mens peracetylated fosfolipider ikke. </li><li> Tørk fraksjoner ved Speedvac i 2 timer og deacetylate med 2 ml 0,5 M natriummetoksyd [Sigma-Aldrich, 403067] i 2 ml metanol i 3 timer ved romtemperatur. </li><li> Nøytralisere blandingen med 3 ml metanolisk eddiksyre [eddiksyre / metanol 15/85 v / v], tørr ved Speedvac, avsalte ved dialyse [Oppløs de tørkede produkter i 3 ml vann, og sprøyte inn i Slide-A-Lyzer dialyse Kassett, Dialyser mot vann i 24 timer. Endre vann minst to ganger]. Tørke dialysert GSLs (i vannløsning) ved Speedvac frem til prøvene er helt tørre. </li&gt; </ol> 3. Kjemisk modifisering (Permethylation) av glykosfingolipider 13 <ol><li> Introduser GSLs (1-20 ug) i et glassrør med en skrukork og Teflon liner, og legge dimetylsulfoksyd (150 ul) uten bruk av spesialverktøy tørkeforhold eller inert gassatmosfære. </li><li> Forbered pulverisert natriumhydroksyd (40-60 mg) fra natriumhydroksydpellets partikler ved slipe dem i en kjemisk morter med en støter. Sørg for å lagre pulver i et svært tørt miljø og være forsiktig med å gjøre sliping i den kjemiske hette for å unngå å puste pulver. </li><li> Deretter tilsettes den natriumhydroksyd pulver til prøveløsningen med en spatel. Legg jodmetan (80 ul) med en 100 mikroliter Halmilton sprøyten, [eller en 100 mikroliter VWR kalibrert pipette knyttet til en sprøyte gjennom gummi rør kan brukes] og riste blandingen ved romtemperatur i 1 time. </li><li> Slukke metylering reaksjonen med vann (2 ml). Pakk ut permethylated produkter 3 ganger ettertilsetningen av diklormetan (2 ml) [glykolipider er i diklormetan fasen, som er den nedre fase, slik at øvre fase, kan overføres til en ny glassrør, og ekstrahert på nytt med diklormetan]. </li><li> Vask den kombinerte diklormetanekstraktene 3 ganger med 2 ml vann [den øvre fase, som er vann, kan deretter kastes]. Etter siste vask, overføre prøvene til et nytt rør, og tørre å bruke Speedvac. </li><li> Prøver kan deretter bli oppløst i 100 til 200 pl metanol for ESI-MS-analyse. </li></ol> 4. MALDI-TOF Analyse av Permethylated Gycosphingolipids <ol><li> Utfør MALDI-TOF-MS og MALDI-TOF/TOF-MS/MS eksperimenter på en MALDI TOF-TOF massespektrometer (Applied 4700 Biosystems, Foster City, CA). Klargjør matrisen ved å blande 50% volum av 10 mg / ml dihydroxybenzoic syre (DHB) i acetonitril og 50% volum av 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) i vann. </li><li> Den DHB matrise kan bli oppdaget på MALDI TARGEt (1 ul), etterfulgt av en 1 pl (inneholdende 100 ng GSLs) flekk av prøven oppløst i metanol. Påfør sakte og la det tørke før analyse. </li></ol> 5. Ion Trap MS Analyse av Permethylated glykosfingolipider <ol><li> Utføre massespektrometri på en lineær ion felle massespektrometer (LTQ, ThermoScientific, San Jose, CA) ved hjelp av en nanoelectrospray kilde, 0,30 ul / min flow rate på 230 ° C kapillær temperatur i positiv ion modus med 30-50% kollisjon energi. Still kollisjon energier å forlate en minimal residual overflod av forløperen ion. Detektere alle ioner som natrium addukter. </li><li> Identifiser iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) i en isobaric blanding av Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) og iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) standarder ved å sammenligne de ulike mønstre av MS 4 produkt ioner fra sodiated molekylære ion via glycan fragment m / z 667 og terminalen disakkaridet 1 - ene ion m / z 445 (dvs.X → 667 → 445 →, X betyr det molekylære ion oppdaget ved MS 1) av rene permethylated iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) standarder via ESI-LIT-MS med de av permethylated Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

<ol>
	<li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+Glycosphingolipids.">Chapter 10 Glycosphingolipids.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Bendelac, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17+NKT+cells+and+other+Innate-like+T+and+B+lineages.">Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages.</a> Fundamental Immunology. , (2011).</li><li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+shigella+diarrhea.+XI.+Isolation+of+a+shigella+toxin-binding+glycolipid+from+rabbit+jejunum+and+HeLa+cells+and+its+identification+as+globotriaosylceramide.">Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide.</a> J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).</li><li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+function+of+iGb3.">The immunological function of iGb3.</a> Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).</li><li>Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+glycolipid+prevents+autoimmune+encephalomyelitis+by+inducing+TH2+bias+of+natural+killer+T+cells.">A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells.</a> Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).</li><li>Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mapping+of+glycomes:+implications+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).</li><li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus.">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li><li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+quantitation+of+isoglobotriaosylceramide+in+the+presence+of+isobaric+components+using+electrospray+ionization-ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).</li><li>Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+isoglobo+and+globo+series+tetraglycosylceramides+in+human+thymus+by+ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).</li><li>Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+permethylation+of+glycolipid,+and+polysaccharide+catalyzed+by+methylsulfonyl+carbanion+in+dimethyl+sulfoxide.">A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide.</a> J. Biochem. (Tokyo). 55, 205 (1964).</li><li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simultaneous+methylation+of+fatty+and+hydroxy+fatty+acids+for+gas-liquid+chromatographic+analysis.">Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis.</a> Carbohydr. Res. 131, 209 (1984).</li><li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li><li>Levery, S. B., Hakomori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+methylation+analysis+of+glycolipids+using+capillary+gas+chromatography-chemical+ionization+mass+fragmentography+with+selected+ion+monitoring.">Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring.</a> Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).</li><li>Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+polyfucosylated+lactosaminoglycan+from+human+granulocytes.">Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).</li><li>Ciucanu, I., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oxidative+degradation+during+the+per-O-methylation+of+carbohydrates.">Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 16213 (2003).</li><li>Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-butyldeoxygalactonojirimycin+inhibits+glycolipid+biosynthesis+but+does+not+affect+N-linked+oligosaccharide+processing.">N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.</a> J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).</li><li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47+Structural+Analysis+of+Glycans.">Chapter 47 Structural Analysis of Glycans.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib:+an+MSn+spectral+library.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li></ol>

DZ er konsulent for BioTex, Houston, TX, og en oppfinner som er involvert i patenter relatert til teknologier som er nevnt i denne artikkelen, utstedt eller i søknaden.

Den glycome, et begrep brukt i analogi til genomet og proteom, refererer til alle saccharide strukturer til en organisme. Å fullt ut forstå de mangfoldige funksjoner glykosylering vil kreve en helhetlig tilnærming som inkluderer både funksjonelle og strukturelle glycomics studier. Begge er komplisert av den ikke-malen drevet natur glycan biosyntese, den resulterende kompleksiteten og mangfoldet av sukkerkjedene strukturer, hyppig involvering av aglycone struktur i modulerende sukkerkjedene ligand-reseptor interaksjoner på molekylært nivå, og den funksjonelle betydningen av lav overflod ligander. Det er generelt akseptert at massespektrometri (MS) er en uunnværlig metode for strukturelle glycomics studier, spesielt for å identifisere og karakterisere lav overflod ligander. Å observere glykaner eller glycoconjugates som molekylære arter, vi ofte bruker en svært effektiv, lav energi ionisering metoden, som kalles electrospray ionisering (ESI). For mer Detfeilte karakterisering av glycan struktur, er det viktig å velge individuelle molekylære arter og bryte glykaner i mindre biter. Dette gjøres normalt ved kollisjon-indusert dissosiasjon, som innebærer aktivering av glykaner gjennom kollisjon med inerte gassmolekyler. Den økte energi induserer bindingen brekkasje, og systematisk analyse av de resulterende fragmenter gir informasjon om den molekylære struktur av glykan. Ofte kan &quot;signatur&quot; fragmenter bli generert som er diagnostisk for spesielle sukkerkjedene strukturelle trekk. Sammen med molekylvekt, kan disse fragmenter iblant være tilstrekkelig for å identifisere glykaner, men i det siste mye mer informasjon er nødvendig for å fullt karakterisere dem, spesielt hvis strukturen er romanen. Disse metodene inkluderer sukker sammensetning analyse, gasskromatografi massespektrometri analyse av delvis denaturert alditol acetates for trepunkt analyse, og bestemte glycosidase fordøyelsen 17. 18-19, flere runder med lav energi fragmentering, som kan effektivt utføres i et ione-felle massespektrometer (IT-MS), i stor grad forbedrer den informasjonen utbyttet fra glykan massespektralanalyse . Med fire eller fem runder fragmentering (som ikke kan gjøres med andre MS instrumenter), er det mulig å skille isomere glykaner som inneholder de samme sukker komponentene anordnet i ulike sukkerarter sammenhengene, selv når disse er til stede sammen i blandinger av komponenter med samme Molekylmassen (isobarer). For denne analysen, var glykaner derivatisert, erstatte alle gratis hydroksylgrupper med metylgrupper hjelp permethylation. Mens strukturelle overdragelse av glykaner er mulig uten permethylation, øker permethylation følsomheten 17. Levery og Zhou, har kombinert alle de potensielle fordelene ved IT-MS metode, herunder påvisning av isomere structures hjelp signatur diagnostiske ioner, observerbare bare i MS 4 og MS 5 spektra for den svært følsomme identifisering og kvantifisering av glykosfingolipider stede i form av flere isobariske blandinger 7-9. I teorien kan vi være i stand til å identifisere hver eksisterende glycolipid struktur, påvente av standard glykolipider, som kan være kjemisk syntetiserte. De kritiske trinnene i denne analysen er at utvinningen av GSLs fra biologiske prøver. Vanligvis 80 ug GSL kan utvinnes fra 100000000 tumorceller som RBL. Å generere tilstrekkelig molekylære ioner for flere runder med fragmentering i ion-felle massespektrometre, er minst 10 mikrogram av tumor GSLs nødvendig. Lite utbytte av GSLs under rensingen vil føre til lav overflod av ioner, som ikke kunne bli utsatt for ytterligere fragmentering. Suksessen til analysen er avhengig av mengden av GSLs som blir gjenvunnet. Vanligvis, endelig konsentration av permethylated GSLs bør nå 1 mg / ml, oppløst i metanol, før de blir analysert på en nano-Elektrospray kilde. Grensen for en grundig MS n analyse er avhengig overflod av spesifikt ion i MS en profil. En typisk e 7 ion overflod er nødvendig for en grundig MS 5 analyse. Lite utbytte av GSLs under rensingen kan være forårsaket av tap av GSLs under peracetylation trinn (som fjerner fosfolipider), når per-acetylerte GSLs må bindes til Florisil harpiks kromatografikolonne, vasket, og deretter eluert. For å sikre bindingen av per-acetylerte GSLs til silikagel, må prøvene reloaded to ganger til kromatografikolonne etter strømme gjennom.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2 Dichloroethane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34872</td>
 <td>Carcinogenic </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>VMR</td>
 <td>JT9524-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic anhydride</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>45830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A18P-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C606-1 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE Sephadex A25 (Cl Form)</td>
 <td>GE Healthcare Biosciences</td>
 <td>AB 17&mdash;170-01 </td>
 <td>100 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane (anhydrous): </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>457116 </td>
 <td>100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichloroacetic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D54702 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis cassette </td>
 <td>Fischer(Pierce) </td>
 <td>66110 </td>
 <td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>20684 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl acetate </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>UN1173 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Florisil</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>46384 </td>
 <td>for packing chromatography column</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hexanes </td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0290-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodomethane </td>
 <td>Riedel de Haen, Germany</td>
 <td>03810 </td>
 <td>stabilized with silver foil Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol </td>
 <td>VWR/EMD</td>
 <td>MXO475-1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral glycosphingolipid Qualmix </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1505</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monosialganglioside mixture</td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1508</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disialoganglioside mixture </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1509</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lactosyl ceramide and sialosylderivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1511</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyridine: </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>270407 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide: </td>
 <td>BDH </td>
 <td>0292 </td>
 <td>500 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium methoxide </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>404367 </td>
 <td>0.5 M solution in methanol</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Toluene </td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>9351-03 </td>
 <td>4 L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Name of the equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber glass (glass wool)</td>
 <td>Corning Incorporated</td>
 <td>3950 </td>
 <td>Pyrex 9989 glass</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm glass tubes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-962-10B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calibrated pipettes (100 microlitter)</td>
 <td>VMR</td>
 <td>53432-921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-961-29 </td>
 <td>With screw caps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Caps for glass tubes</td>
 <td>Kimble</td>
 <td>40566C </td>
 <td>size/13-415 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Merck TLC plates</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 29, 301-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tank for TLC</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 12,619-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps </td>
 <td>Drummond scientific company</td>
 <td>1-000-0100 </td>
 <td>10 &mu;l, for loading of TLC samples</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sunrise Microplate Absorbance Reader</td>
 <td>Tecan</td>
 <td>A-5082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Whatman Chromatography Paper</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>05-716-3E</td>
 <td>18 cm x 34 cm For TLC Tank</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Orcinol ferric chloride spray reagent</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>O7875</td>
 <td>For detecting glycosphingolipids on TLC plates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Prevel Spray Unit</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 36,555-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sonicator</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>Legend RT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Speedvac</td>
 <td>Savant</td>
 <td>AS160 </td>
 <td>With chemical trap for organic solvants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF-TOF Mass spectrometer</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Proteomics 4700 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ion Trap Mass spectrometer</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>LTQ </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens

Glykosfingolipider (GSL er) tilhører glycoconjugate klasse av Biomacromolecules, som bærer strukturell informasjon for betydelige biologiske prosesser som embryoutvikling, signaltransduksjon, og immun reseptor anerkjennelse 1-2. De inneholder komplekse sukker molekyldeler i form av isomerer, og lipid molekyldeler med varianter, inkludert fettsyre acylkjedelengde, umettethet, og hydroksylering. Både karbohydrater og ceramid deler kan være grunnlag for biologisk betydning. For eksempel, tri-hexosylceramides inkluderer globotriaosylceramid (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) og isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), som har identiske molekylære masser men distinkte sukker bindinger av karbohydrat moiety, ansvarlig for helt andre biologiske funksjoner 3-4. I et annet eksempel har det blitt vist at modifikasjon av Ceramide delen av alfa-galactosylceramide, en potent agonist ligand for invarimaur NKT-celler, endringer sine cytokin sekresjon profiler og funksjon i dyremodeller av kreft og auto-immune sykdommer 5. Vanskeligheten med å utføre en strukturell analyse av isomerene i immun organer og celler tjene som en barriere for å bestemme mange biologiske funksjoner 6. Her presenterer vi en visualisert versjon av en metode for relativt enkel, rask og følsom analyse av glykosphingolipid profiler i immunceller 7-9. Denne metoden er basert på utvinning og kjemisk modifisering (permethylation, se nedenfor Fig. 5A, ble alle OH-grupper av hexose erstattet av MeO etter permethylation reaksjon) av glykosfingolipider 10-15, etterfulgt av etterfølgende analyse ved hjelp av matrise-assistert laser desorpsjon / ionisering tid- of-flight massespektrometri (MALDI-TOF/MS) og ion felle massespektrometri. Denne metoden krever 50 millioner immunceller for en fullstendig analyse. Forsøkene kan gjennomføres innen en uke. Den relative overflod av de ulike glykosfingolipider kan være avgrenset ved sammenligning til syntetiske standarder. Denne metoden har en sensitivitet på måle 1% iGb3 blant Gb3 isomerer, når 2 fmol av totalt iGb3/Gb3 blandingen er tilstede 9. Ion felle massespektrometri kan brukes til å analysere isomerene. For eksempel for å analysere tilstedeværelsen av globotriaosylceramid og isoglobtriaosylceramide i samme prøve, kan man bruke fragmentering av glykosphingolipid molekyler til strukturelt diskriminere mellom de to (se nedenfor Figur 5). Videre forbedrer kjemisk modifisering av sukker enheter (gjennom en permethylation reaksjon) ionisering og fragmentering effektivitet for høyere sensitivitet og spesifisitet, og øker stabiliteten av Sialic syrerester. Utvinningen og kjemisk modifisering av glykosfingolipider kan utføres i en klassisk sertifisert kjemisk hette, og massespektrometri kan utføres av kjerneanlegg med ion felle MS instrumenter.

Et eksempel på en MALDI MS analyse av glykosfingolipider fra rotte leukemi cellelinje RBL (en antigenpresenterende celle som presenterer attraksjon glykosphingolipid antigener til NKT celler) er vist i figur 3.. Ionene kan tilordnes bestemte glykosphingolipid strukturer (figur 3A). I RBL celler behandlet med 16 NB-DGJ, et stoff som inhiberer glykosphingolipid syntese, betydelig reduksjon av alle glykosfingolipider ble observert (figur 3B). Strukturelle isomerer kan ikke skilles fra hverandre. MS / MS kapasitet Applied Biosystems 4700 tillater fragmentering av MS1 ionene til MS 2 fragmenter, slik begrenset strukturell informasjon som skal genereres. Imidlertid er MS2 analyse ofte ikke tilstrekkelig til å diskriminere oligosakkarid isomerer. Den Ion-Trap MS analyse av glykosfingolipider gjør studiet av isomerer, som iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) og Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) som kan eksistere som den trihexosylceramide ioner påvist i figur 3A. For å oppdage slike isomerer, ble standard iGb3 og Gb3 analysert ved flere runder med fragmentering, inntil forskjeller ble funnet (Figur 4a og 4b). I eksempelet som presenteres her (figur 5C) iGb3 og Gb3 kunne bli diskriminert ved å sammenligne standard iGb3 og Gb3. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Figur 1. Flytskjema av glykosphingolipid ekstraksjonsmetode, og kjemisk modifisering av glykosfingolipider (permethylation). Glykosfingolipider ble ekstrahert fra cellene ved organiske oppløsningsmidler. Å fjerne ikke-glykosfingolipider kan lipider være peracetylated og deacetylert. Sekund, ble glykosfingolipider kjemisk modifisert av en permethylation reaksjon, forbedrer som sensitivitet og spesifisitet MS detection. Til slutt ble de glykosphingolipid profilene bestemt ved bruk MALDI-TOF massespektrometri og ion felle massespektrometri. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Figur 2. Glykosphingolipid Kvantifisering ved orcinol Svovelsyre Metode: Kvantifisering av glykosfingolipider med en 0,2% orcinol i 50% svovelsyreoppløsning og en glukose standardkurve. <img alt="Figur 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Figur 3. Glycosphingolipidomics av rotte leukemiceller A. Representative MALDI Massespektrum;. Hvert ion representerer et spesifikt glykosphingolipid struktur, kan strukturelle isomerer ikke skjelnes B. NB-DGJ, et stoff som hemmer glykosphingolipid syntese, s.ignificantly reduserer alle glykosfingolipider produsert i RBL celler. <img alt="Figur 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Figur 4. Tandem massespektrometri av isomerer av glykosfingolipider. A. Karakteristiske spaltningsprodukter trasé for positiv modus ion felle massespektrometri av permethylated GSLs Gb 3 Cer og IGB 3 Cer. Gb 3 og IGB 3 er klart atskilt med sine fragmentering mønstre. Forskjellene i sammenheng er reflektert i MS 4 produkt ioner i samsvar med de isobariske m / z 445 forløpere. B. Representative resultater som viser iGB3 kan måles i en blanding av isomerer iGb3/Gb3. Stjernene viser diagnostiske ioner for iGb3 bare. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å</a>se større figur. <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Figur 5. Ion felle MS tillater analyse av isomerer av glykosfingolipider. A. Standard iGb3 og Gb3 viser forskjell på fragmentering profil etter 4 runder med fragmentering i et ion felle LTQ massespektrometer. B. Karakteristisk MS 4 profil av ioner som stammer fra iGb3 eller Gb3. C. Trihexosyleramides er blandinger av iGb3 og Gb3 isomerer som kan identifiseres ved ion felle MS metode (Figur av Dapeng Zhou). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens at JoVE.com

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

En spesifikk og sensitiv metode for å få innsikt i uttrykket profilen glykosphingolipid antigener i immun organer og celler er beskrevet. Metoden utnytter ion felle massespektrometri tillater trinnvis fragmentering av glykosphingolipid molekyler for strukturell analyse i forhold til kjemisk syntetiserte standarder.

Massespektrometrisk Analyse av glykosphingolipid Antigener

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener Beskyttet Funksjonell røde blodceller av membranen Pode av kompakt hyperforgrenede Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Utvikling av en Antigen-drevet kolitt modell for å studere presentasjon av antigener ved hjelp av antigenpresenterende celler til T-celler

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Ved hjelp av røntgenkrystallografi, biofysikk og funksjonelle analyser fastslår mekanismer som styrer T-celle reseptor Anerkjennelse av kreft antigener

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Rensing av membran kupé for endoplasmatiske retikulum-assosiert nedbrytning av eksogene antigener i Cross-presentasjon

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Uttrykk for eksogene antigener i Mycobacterium bovis BCG vaksinen via ikke-genetiske overflaten dekorasjon med Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman mater-fritt System for masseproduksjon av Murine naturlige drepe celler In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Én celle analyse av Immunophenotype og cytokin produksjon i eksterne fullblod via masse cytometri

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Spore adsorpsjon som Nonrecombinant Display System for enzymer og antigener

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

Identifisering av Nucleolar faktorer under HIV-1-replikering gjennom rev Immunutfelling og Mass massespektrometri

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...