Name: mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00
Duration: 13 min 9 s
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DZ é suportado pelo MD Anderson Cancer Center e bolsas NIH AI079232. MD Anderson Cancer Center é apoiado em parte pelo NIH concessão CA16672.

1. Preocupações de segurança em laboratório <ol><li> Todos os solventes orgânicos devem ser armazenados em áreas específicas, com rotulagem clara. Veja rótulos pelos fabricantes para os tipos de extintores de incêndio necessários. </li><li> Vários reagentes utilizados são potencialmente carcinogénico e pode causar depressão mental. Estes reagentes devem ser tratados de uma capa química com ventilação (Veja a tabela de reagentes e equipamentos específicos para fins específicos). </li><li> Recomenda-se que ao trabalhar com solventes orgânicos, e as células, o equipamento de protecção individual, como luvas, bata e óculos de protecção ser utilizados em todos os momentos. </li></ol> 2. Extracção de Glicoesfingolipídeos de células de leucemia de rato <ol><li> Loja de ratos RBL células de leucemia 8 (de 10 a 100 milhões) em tubos de vidro 16x100 mm sob -80 ° C condições. As células são contadas por um hemocitómetro após coloração com azul de tripano. Viabilidade das células deve ser superior a 95%. </li><li> Extraia os lipídios usando sonicat extensaion quatro vezes para cada 1-2 horas com solventes de polaridade mistos. Use 6 ml de clorofórmio-metanol 1:1 (v / v) como solvente e sobrenome. Seis mililitros de isopropanol: hexano: H2O 55:25:20 (v / v / v, fase superior remover por aspiração antes da utilização) pode então ser utilizado como o solvente de segundo e terceiro. Este solvente é preparado por mistura de isopropanol: hexano: H 2 O numa proporção de 55:25:20, com agitação vigorosa, e uma fase superior que permite a aparecer, o qual será removido. Manter a fase inferior para utilização. </li><li> Siga sonicação com centrifugação para sedimentar o material insolúvel. A piscina do sobrenadantes. Secá-los num Speedvac durante 4 h. Corrente de azoto ou evaporador rotativo pode ser usado se Speedvac não está disponível. Use uma boa armadilha frio para segurar evaporaram solventes orgânicos. A contaminação de um solvente orgânico no óleo da bomba de vácuo irá diminuir a eficiência da bomba de vácuo. </li><li> Faça uma análise preliminar usando alto desempenho cromatografia em camada delgada (HPTLC). Para quantificar glicolipídios, Preparar uma orcinol a 0,2% em solução de ácido sulfúrico a 50% (100 mg em 50 ml) e um padrão de Galactose (40 mg em 100 ml de solução concentrada). Preparar, em 30 ul de volume de reacção de uma série de diluições para usar como curva padrão (de 0 g / L até 20 g / L). Adicionar 20 ul de metanol a cada amostra de séries de diluição. Dissolver cada amostra de glicolípidos em 200 ul de metanol, sonicar, e utilizar para a medição de 20 ul quantidade de glicolípidos. Em tubos de 1,5 ml de Eppendorf com tampas roscadas (Sarstedt, 72.692.005), adicionar 0,4 ml de 0,2% de orcinol em solução de ácido sulfúrico a 50% para cada uma das amostras, com uma série de Galactose-H 2 O-metanol soluções que servem para a curva padrão . Ferver durante 5 min em bloco de aquecimento a 100 ° C. Ler a densidade óptica de reação de cor a 440 nm usando Sunrise Tecan Leitora. Para executar HPTLC, utilizar clorofórmio: metanol: H2O 60:35:8 (v / v / v) como solvente de lipídeos neutros tratados com clorofórmio-metanol 1:1 (v / v). Use isopropanol: hexano: H2O 55:25:20 (v / v / v) comoo solvente para os lípidos ácido (gangliósidos). Os isolados GSLs neutros foi dissolvido em 200 ul de clorofórmio solvente: metanol 1:1 (v / v) e carregado em sílica Merck placa de cromatografia em camada fina de gel por Drummond microcaps. As placas foram analisadas em clorofórmio solvente: metanol: H2O 60:35:8 (v / v / v) e seca-se. Os glicoesfingolípidos foram visualizadas por orcinol-ácido sulfúrico a 300 ° C. </li><li> A fim de separar os lípidos neutros a partir dos ácidos, fracção de lípidos para fora os lípidos neutros e ácidos, por cromatografia de permuta aniónica sobre uma pequena coluna de DEAE Sephadex A-25 [a DEAE Sephadex A25 resina pode ser preparada por imersão de resina Sephadex A-25 pó em clorofórmio: metanol: H2O 30:60:8 (v / v / v) durante a noite. Aspirar o sobrenadante até que a resina Sephadex A25 é tudo o que resta. Adicionar clorofórmio fresco: metanol: H2O 30:60:8 (v / v / v) para lavar a resina. Repetir três vezes para remover os resíduos de carga negativa a partir de Sephadex] resina A25. </li><li> Dissolver, Sonicado (por não mais do que 10 min), e ressuspender os lipidos a partir do passo 2.1 em clorofórmio: metanol: H2O 30:60:8 (v / v / v), quando necessário. </li><li> Prepara-se uma pequena DEAE Sephadex A25 (Cl) Forma coluna usando lã de vidro e um 9 &quot;pipeta de Pasteur. Embalar a lã de vidro cuidadosamente, de modo que o pó de resina não passar através da coluna. Adicionar DEAE Sephadex A25 (Forma Cl) de resina para o&quot; pescoço &quot;da 9&quot; pipeta de Pasteur, sem deixar que a coluna seca. Certifique-se que você não vê qualquer resina em eluente. As amostras dissolvidas em clorofórmio: metanol: H2O 30:60:8 (v / v / v) foram dissolvidos. A fracção de lípido neutro é o fluxo através da fracção. </li><li> Eluir a fracção de lípido acídico (ligada às resinas) com 8 ml de acetato de sódio em metanol. Secar ambas as fracções neutros e ácidos, dessalinizar los por diálise, secá-los por Speedvac e analisá-las por HPTLC. </li></ol> A fracção ácida contém gangliósidos, que podem ser dialisados ​​para a reacção 3 Passo directamente.A fracção neutra contém não só glicoesfingolípidos neutros, mas também fosfolípidos (fosfatidilcolina e esfingomielina), que devem ser removidos por uma reacção de acetilação. Na nossa experiência, o método de uma cassete de diálise, é mais eficiente e conveniente do que um tubo de diálise ou cromatografia de coluna de fase reversa C18. <ol start="9"><li> O próximo passo é a remoção de fosfolípidos de glicoesfingolípidos neutros por uma reacção de acetilação e peracetylation. Seca-se o Sephadex DEAE A-25 fracção de passagem no Speedvac (com arrefecimento) durante 4 horas. Depois que as amostras são secas, colocá-los de volta para o Speedvac e seco para outro hr 4. Assegure-se que estas amostras são completamente seco, qualquer água residual que vai impedir que a reacção peracetylation. </li><li> Peracetylate as amostras com 1 ml de piridina e 0,5 ml de anidrido acético, no escuro, à temperatura ambiente ou a 37 ° C durante a noite. Esta quantidade de anidrido acético e piridina é adequada para sede 200 ug de glicoesfingolípidos. Esta reacção pode ser realizada a 37 ° C, enquanto os GSLs têm melhor solubilidade. </li><li> Secar o material peracetilado por Speedvac durante 3 horas, com a adição de 1 ml de tolueno 3x (coevaporação) para assegurar a completa evaporação. Se as amostras não são ainda completamente seco, Speedvac até secar. </li><li> Prepara-se uma coluna de Florisil (Sigma-Aldrich) (30-60 mesh, 10 x 80 mm) de uma pipeta de Pasteur com a lã de vidro, utilizando esferas de Florisil. Grânulos de florisil deve ser completamente seco antes da sua utilização, por incubação num forno a 110 ° C. Encha as pérolas na pipeta Pasteur até ao pescoço, e equilibrar em 1,2-dicloroetano-hexano 4:1 (v / v). </li></ol> A eluição a partir da coluna de Florisil é muito rápido. Volatilidade rápida dos solventes pode conduzir à secagem da coluna. Assim, todas as misturas de solventes deve ser preparada antes de correr a coluna, uma vez que não é possível parar a coluna durante a eluição. <ol start="13"><li> Aplique o peracetílicoated amostra em 1 ml de 1,2-dicloroetano-hexano 4:1 (v / v), e lava-se a coluna com 6 ml do mesmo solvente, seguindo-se 10 ml de 1,2-dicloroetano. Eluir neutros GSLs peracetilado com 6 ml de 1,2-dicloroetano-acetona 1:1 (v / v). Este passo remove os fosfolípidos peracetilado de glicoesfingolípidos, porque os glicoesfingolípidos peracetilado liga à coluna de Florisil, enquanto fosfolípidos peracetilado não. </li><li> Secam-se as fracções por Speedvac durante 2 horas e desacetilar com 2 ml de metóxido de sódio 0,5 M [Sigma-Aldrich, 403067] em 2 ml de metanol durante 3 horas à temperatura ambiente. </li><li> Neutraliza-se a mistura com 3 ml de ácido acético metanólico [ácido acético / metanol 15/85 v / v], seco por Speedvac, desalt por diálise [Dissolver os produtos secos, em 3 ml de água, e injectar no Slide-A-Lyzer Cassete de diálise, dializar contra água durante 24 h. Troque a água pelo menos duas vezes]. Secar os GSLs dialisados ​​(em solução aquosa) por Speedvac até as amostras estarem completamente secos. </li&gt; </ol> 3. Chemical Modification (permetilação) de 13 Glicoesfingolipídeos <ol><li> Introduzir GSLs (1-20 ug) para um tubo de vidro com tampa de rosca e revestimento de teflon, e adicionar sulfóxido de dimetilo (150 ul) sem o uso de condições de secagem especiais ou atmosfera de gás inerte. </li><li> Preparar hidróxido de sódio em pó (40-60 mg) a partir de partículas de hidróxido de sódio moendo-se num almofariz com um pilão de química. Certifique-se de armazenar os pós em um ambiente muito seco e ter o cuidado de fazer a retificação na capa química para evitar respirar o pó. </li><li> Em seguida adicione o pó de hidróxido de sódio à solução de amostra, com uma espátula. Adicionar iodometano (80 uL) com uma seringa de 100 microlitros Halmilton, [ou um VWR microlitro 100 calibrado pipeta ligada a uma seringa através de uma tubagem de borracha podem ser usados], e agitar a mistura à temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Extingue-se a reacção de metilação com água (2 ml). Extrair os produtos permetilada 3 vezes pora adição de diclorometano (2 ml) [glicolipidos estão em fase de diclorometano, que é a fase mais baixa, então a fase superior é transferida para um tubo de vidro de novo, e foi extraída de novo com diclorometano]. </li><li> Lavar os extractos combinados de diclorometano a 3 vezes com 2 ml de água [a fase superior, que é a água, pode então ser eliminados]. Após a lavagem final, transferir as amostras para um novo tubo, e secar utilizando o Speedvac. </li><li> As amostras podem então ser dissolvido em 100 a 200 ul de metanol para análise ESI-MS. </li></ol> 4. MALDI-TOF Análise dos Gycosphingolipids permetilada <ol><li> Executar MALDI-TOF-MS e MALDI-TOF/TOF-MS/MS experiências num TOF-TOF MALDI Mass Spectrometer (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Preparar a matriz através da mistura de volume de 50% de 10 mg / ml de ácido di-hidroxibenzóico (DHB) em acetonitrilo e 50% de volume de 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) em água. </li><li> A matriz DHB pode ser visto no targe MALDIt (1 ul), seguido por um pi 1 (contendo 100 ng GSLs) mancha da amostra dissolvida em metanol. Aplicar lentamente e deixá-la secar antes da análise. </li></ol> 5. Ion trap MS Análise de Glicoesfingolipídeos permetilada <ol><li> Realizar a espectrometria de massa de um espectrómetro de massa linear ion trap (LTQ, ThermoScientific, San Jose, CA), utilizando uma fonte de nanoelectrospray, 0,30 caudal ul / min a 230 ° C de temperatura capilar em modo de ião positivo com uma energia de colisão de 30-50%. Definir as energias de colisão para deixar uma abundância mínima residual do ião precursor. Detectar todos os iões de sódio como adutos. </li><li> Identificar o iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) numa mistura de Gb3 isobárica (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) e (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) iGb3 padrões ao comparar os diferentes padrões de MS quatro iões dos produtos a partir do ião molecular sodiated através do fragmento de glicano m / z 667 e do terminal de dissacarídeo 1 - eno ião de m / z 445 (isto é,X → 667 → 445 →, X significa o ião molecular detectado em MS 1) de puras permetilada iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) Normas via ESI-LIT-MS com as do permetilada Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

<ol>
	<li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+Glycosphingolipids.">Chapter 10 Glycosphingolipids.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Bendelac, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17+NKT+cells+and+other+Innate-like+T+and+B+lineages.">Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages.</a> Fundamental Immunology. , (2011).</li><li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. 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S3, 1520-1532 (2011).</li><li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus.">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li><li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. 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R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47+Structural+Analysis+of+Glycans.">Chapter 47 Structural Analysis of Glycans.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib:+an+MSn+spectral+library.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li></ol>

DZ é um consultor para Biotex, Houston, TX, e um inventor envolvido em patentes relacionadas a tecnologias mencionadas neste artigo, emitidos ou na aplicação.

O glycome, cunhado em analogia com o genoma e proteoma, refere-se a todas as estruturas de sacarídeos de um organismo. Para compreender plenamente as funções múltiplas de glicosilação exigirá uma abordagem integrada, incluindo ambos os estudos funcionais e estruturais Glicômica. Ambos são complicados pela natureza não-molde dirigido de glicano biossíntese, a complexidade resultante e diversidade de estruturas de glicano, o frequente envolvimento de estrutura aglicona na modulação de glicano interacções ligando-receptor ao nível molecular, bem como a importância funcional de ligandos de baixa abundância. É geralmente aceite que a espectrometria de massa (MS) é um método indispensável para estudos estruturais Glicômica, especialmente para identificação e caracterização de ligandos de baixa abundância. Para observar glicanos ou glicoconjugados como espécies moleculares, muitas vezes usamos um altamente eficiente, o método de ionização baixa energia, chamado de ionização electrospray (ESI). Para mais detailed caracterização da estrutura de glicano, é essencial para seleccionar espécies moleculares individuais e quebrar os glicanos em pedaços menores. Isto é normalmente feito por dissociação induzida por colisão, o que envolve a activação dos glicanos por colisão com as moléculas de gás inerte. O aumento da energia induz quebras ligação, e uma análise sistemática dos fragmentos resultantes fornece informações sobre a estrutura molecular do glicano. Muitas vezes, &quot;assinatura&quot; de fragmentos pode ser gerada, que é diagnóstico para determinadas características estruturais de glicano. Em conjunto com a massa molecular, estes fragmentos podem, por vezes, ser suficiente para a identificação de glicanos, mas no passado muito mais informação tiver sido solicitada para caracterizar completamente a eles, em particular, se a estrutura é nova. Estes métodos incluem a análise de açúcar a composição, a análise de cromatografia gasosa espectrometria de massa de parcialmente metilados alditol acetatos para a análise de ligação e digestão glicosidase específico 17. 18-19, múltiplos ciclos de fragmentação de baixa energia, o qual pode ser eficazmente levada a cabo num espectrómetro de massa de armadilha de iões-(IT-MS), melhora significativamente o rendimento de informações a partir de glicano análise espectral de massa . Com quatro ou cinco ciclos de fragmentação (que não pode ser feito com outros instrumentos de MS), é possível distinguir glicanos isoméricas que contêm os componentes de açúcar mesmas dispostas em ligações de açúcar diferentes, mesmo quando estes estão presentes em conjunto em misturas de componentes com a mesma massa molecular (isóbaras). Para esta análise, os glicanos foram derivatizadas, substituindo todos os grupos hidroxilo livres com grupos metilo utilizando permetilação. Enquanto atribuição estrutural dos glicanos é possível sem permetilação, a permetilação aumenta a sensibilidade 17. Levery e Zhou, têm combinado de todas as vantagens potenciais da TI-MS metodologia, incluindo a detecção de isomérica structures utilizando iões de assinatura de diagnóstico, apenas observáveis ​​em MS 4 e 5, os espectros de MS para a identificação de elevada sensibilidade e quantificação de glicoesfingolípidos presentes sob a forma de misturas de várias isobáricas 7-9. Em teoria, pode ser capaz de identificar cada estrutura glicolipídeo existente, enquanto se aguarda a disponibilidade de glicolipídeos padrão, que podem ser sintetizados quimicamente. Os passos críticos dessa análise são a taxa de recuperação de GSLs de amostras biológicas. Tipicamente 80 ug de GSL podem ser recuperados a partir de 100 milhões de células de tumor, tais como RBL. Para gerar suficientes iões moleculares para múltiplos ciclos de fragmentação em espectrómetros ion-trap de massa, pelo menos 10 microgramas de GSLs tumorais são necessários. Baixo rendimento durante a purificação de GSLs conduzirá a baixa abundância de iões, que não podiam ser submetidos a nova fragmentação. O sucesso da análise é dependente da quantidade de GSL que são recuperados. Tipicamente, concentração finalentration de GSLs permetilada deve chegar a 1 mg / ml, dissolvida em metanol, antes de ser analisado numa fonte de nano-electrospray. O limite de uma análise minuciosa MS n depende da abundância de iões específico em MS perfil 1. Um típico e abundância de iões 7 é necessário para uma completa análise MS 5. O baixo rendimento de GSLs durante a purificação pode ser causada por uma perda de GSLs durante o passo peracetylation (que remove os fosfolípidos), quando os GSLs per-acetilados devem ser ligados a resina de cromatograf ia de coluna de Florisil, lavou-se, e subsequentemente eluída. A fim de assegurar a ligação de per-acetilados GSLs para gel de sílica, as amostras devem ser recarregado duas vezes para a coluna de cromatograf ia depois flui através.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2 Dichloroethane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34872</td>
 <td>Carcinogenic </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>VMR</td>
 <td>JT9524-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic anhydride</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>45830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A18P-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C606-1 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE Sephadex A25 (Cl Form)</td>
 <td>GE Healthcare Biosciences</td>
 <td>AB 17&mdash;170-01 </td>
 <td>100 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane (anhydrous): </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>457116 </td>
 <td>100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichloroacetic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D54702 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis cassette </td>
 <td>Fischer(Pierce) </td>
 <td>66110 </td>
 <td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>20684 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl acetate </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>UN1173 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Florisil</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>46384 </td>
 <td>for packing chromatography column</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hexanes </td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0290-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodomethane </td>
 <td>Riedel de Haen, Germany</td>
 <td>03810 </td>
 <td>stabilized with silver foil Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol </td>
 <td>VWR/EMD</td>
 <td>MXO475-1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral glycosphingolipid Qualmix </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1505</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monosialganglioside mixture</td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1508</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disialoganglioside mixture </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1509</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lactosyl ceramide and sialosylderivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1511</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyridine: </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>270407 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide: </td>
 <td>BDH </td>
 <td>0292 </td>
 <td>500 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium methoxide </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>404367 </td>
 <td>0.5 M solution in methanol</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Toluene </td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>9351-03 </td>
 <td>4 L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Name of the equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber glass (glass wool)</td>
 <td>Corning Incorporated</td>
 <td>3950 </td>
 <td>Pyrex 9989 glass</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm glass tubes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-962-10B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calibrated pipettes (100 microlitter)</td>
 <td>VMR</td>
 <td>53432-921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-961-29 </td>
 <td>With screw caps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Caps for glass tubes</td>
 <td>Kimble</td>
 <td>40566C </td>
 <td>size/13-415 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Merck TLC plates</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 29, 301-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tank for TLC</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 12,619-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps </td>
 <td>Drummond scientific company</td>
 <td>1-000-0100 </td>
 <td>10 &mu;l, for loading of TLC samples</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sunrise Microplate Absorbance Reader</td>
 <td>Tecan</td>
 <td>A-5082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Whatman Chromatography Paper</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>05-716-3E</td>
 <td>18 cm x 34 cm For TLC Tank</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Orcinol ferric chloride spray reagent</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>O7875</td>
 <td>For detecting glycosphingolipids on TLC plates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Prevel Spray Unit</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 36,555-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sonicator</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>Legend RT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Speedvac</td>
 <td>Savant</td>
 <td>AS160 </td>
 <td>With chemical trap for organic solvants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF-TOF Mass spectrometer</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Proteomics 4700 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ion Trap Mass spectrometer</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>LTQ </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens

Glicoesfingolípidos (GSL) pertencem à classe de glicoconjugado biomacromoléculas, que levam informações estruturais significativas para os processos biológicos, tais como o desenvolvimento embrionário, a transdução de sinal, e no reconhecimento imunológico do receptor 1-2. Eles contêm porções de açúcar complexos, sob a forma de isómeros, e porções lipídicas, com variações, incluindo comprimento de cadeia acilo gordo, de insaturação, e hidroxilação. Ambas as porções de hidrato de carbono e de ceramida pode ser base de significância biológica. Por exemplo, o tri-hexosylceramides incluem globotriaosilceramida (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) e isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), que possuem massas moleculares idênticas mas ligações de açúcar diferentes de fracção de hidratos de carbono, completamente responsável por diferentes funções biológicas 3-4. Em outro exemplo, demonstrou-se que a modificação da parte ceramida de alfa-galactosilceramida, um ligando agonista potente para invariantecélulas NK, mudanças de formigas seus perfis de citocinas secreção e função em modelos animais de câncer e doenças auto-imunes 5. A dificuldade na realização de uma análise estrutural de isómeros nos órgãos e células imunes servir como uma barreira para a determinação muitas funções biológicas 6. A seguir, apresentamos uma versão visualizada de um método de análise relativamente simples, rápido, sensível e de perfis de glicoesfingolipídeos em células imunes 7-9. Este método baseia-se na extracção e modificação química (permetilação, ver abaixo Figura 5A, todos os grupos OH de hexose foram substituídos por MeO após reacção permetilação) de glicoesfingolípidos 10-15, seguido de posterior análise usando laser assistida por matriz de dessorção / ionização-tempo de vôo espectrometria de massa (MALDI-TOF/MS) e espectrometria de massa de íons armadilha. Este método exige 50 milhões de células imunes para uma análise completa. Os experimentos podem ser concluídas dentro de uma semana. A abundância relativa dos vários glicoesfingolípidos pode ser delineada por comparação com padrões sintéticos. Este método tem uma sensibilidade de medição de 1% entre iGb3 Gb3 isómeros, quando da mistura de 2 fmol iGb3/Gb3 total está presente 9. Espectrometria de massa de iões de captura podem ser utilizadas para analisar os isómeros. Por exemplo, para analisar a presença de globotriaosilceramida isoglobtriaosylceramide e na mesma amostra, pode-se utilizar a fragmentação de moléculas estruturalmente glicoesfingolipídeos a discriminar entre os dois (ver Figura 5 abaixo). Além disso, a modificação química das porções açúcar (por meio de uma reacção de permetilação) melhora a eficiência de ionização e fragmentação de maior sensibilidade e especificidade, e aumenta a estabilidade dos resíduos de ácido siálico. A modificação química de extracção e glicoesfingolípidos pode ser realizada em um capuz clássico químicas certificadas, e a espectrometria de massa pode ser realizada por núcleoinstalações com instrumentos ion trap MS.

Um exemplo de uma análise de MS MALDI dos glicoesfingolípidos de rato RBL linha de leucemia de células (um tipo de célula que apresenta o antigénio que apresenta antigénios glicoesfingolipídeos de células NKT) é mostrado na Figura 3. Os iões podem ser atribuídos a estruturas específicas glicoesfingolipídeos (Figura 3A). Em células RBL tratados por NB-DGJ 16, uma droga que inibe a síntese de glicosfingolípidos, redução significativa de todos os glicoesfingolípidos foi observado (Figura 3B). Isómeros estruturais não podem ser distinguidas. A capacidade de MS / MS do Applied Biosystems 4700 permite a fragmentação de iões MS1 para MS 2 fragmentos, permitindo que a informação estrutural limitado a ser gerado. No entanto, a análise de MS2 muitas vezes não é suficiente para discriminar isómeros de oligossacáridos. O Ion-Trap MS análise de glicoesfingolípidos permite o estudo de isómeros, tais como iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) e Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) que podem existir como os iões trihexosylceramide detectados na Figura 3A. Para detectar esses isómeros, padrão iGb3 Gb3 e foram analisados ​​por múltiplos ciclos de fragmentação, até que foram encontradas diferenças (Figura 4A e 4B). No exemplo aqui apresentado (Figura 5C) e iGb3 Gb3 puderam ser discriminados por comparação com o padrão iGb3 e Gb3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma do procedimento de extracção, glicosfingolípidos e modificação química de glicoesfingolípidos (permetilação). Glicoesfingolipídeos foram extraídas a partir de células por solventes orgânicos. Para remover não-glicoesfingolípidos, lípidos pode ser peracetilado e desacetilado. Em segundo lugar, glicoesfingolípidos foram quimicamente modificados através de uma reacção permetilação, o que melhora a sensibilidade e especificidade do MS detection. Por fim, os perfis glicoesfingolipídeos foram determinados utilizando MALDI-TOF de espectrometria de massa e espectroscopia de massa de iões armadilha. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Figura 2. Quantificação glicosfingolípidos pelo método do ácido sulfúrico orcinol: Quantificação dos glicoesfingolípidos usando um 0,2% orcinol em solução de ácido sulfúrico a 50% e uma curva padrão de glucose. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Figura 3. Glycosphingolipidomics de células de leucemia de rato A. Representante de espectro de massa MALDI, cada ião. Representa uma estrutura específica glicosfingolípidos, isómeros estruturais não podem ser distinguidos B. NB-DGJ, uma droga que inibe a síntese de glicosfingolípidos, s.ignificantly reduz todos os glicoesfingolipídeos produzidos em células RBL. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Figura 4. Tandem Espectrometria de Massa de isómeros de Glicoesfingolipídeos. A. Característica vias de decomposição de modo positivo a espectrometria de massa de íons armadilha de GSLs permetilada 3 GB Cer e igb Cer 3. Gb 3 e IGB 3 são claramente separados por seus padrões de fragmentação. As diferenças na ligação são reflectidos nas 4 ms iões de produtos compatíveis com as isobáricas m / z 445 precursores. B. Os resultados representativos mostrando iGB3 pode ser medido em uma mistura de isómeros iGb3/Gb3. Estrelas indicam íons diagnósticos para iGb3 apenas. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para</a>ver figura maior. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Figura 5. Ion trap MS permite a análise de isômeros de glicoesfingolípidos. A. Padrão iGb3 e Gb3 demonstram diferença de perfil de fragmentação após quatro rodadas de fragmentação em uma armadilha de íons LTQ espectrômetro de massa. B. Característica MS 4 perfil de íons derivados de iGb3 ou Gb3. C. Trihexosyleramides são misturas de isómeros Gb3 iGb3 e que podem ser identificados por método de ion trap MS (Figura Dapeng por Zhou). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Um método específico e sensível para obter informações sobre o perfil de expressão de antígenos glicoesfingolipídeos em órgãos e células do sistema imunológico é descrito. O método tira partido da espectrometria de massa de iões armadilha permitindo passo a passo de fragmentação de moléculas de glicoesfingolipídeos para análise estrutural em comparação com padrões de síntese química.

Análise por espectrometria de massa de Antígenos glicoesfingolipídeos

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Quantificação de Th-1 respostas imunes celulares contra antígenos microbianos

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

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