Name: mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens at JoVE.com

DZ поддерживают MD Anderson Cancer Center и гранты NIH AI079232. MD Anderson Cancer Center будет частично поддержана NIH грант CA16672.

1. Лаборатория проблем безопасности <ol><li> Все органические растворители должны храниться в отдельных районах с четкой маркировки. См. этикетках производители типов огнетушителей требуется. </li><li> Несколько реагентов, используемых являются потенциально канцерогенными, и может привести к депрессии. Эти реагенты должны быть обработаны в химической капот с вентиляционными (см. таблицу специфических реагентов и оборудования для специфики). </li><li> Рекомендуется, чтобы при работе с органическими растворителями и клетки, средства индивидуальной защиты, такие как перчатки, лабораторный халат и защитные очки быть использован в любое время. </li></ol> 2. Добыча гликосфинголипиды из клеток лейкемии крыс <ol><li> Магазин RBL крыс клетки лейкемии 8 (10 млн. до 100 млн.) в 16x100 мм трубы стекло под -80 ° C условиями. Клетки подсчитываются гемоцитометр после окрашивания трипановым синим. Жизнеспособность клеток должна быть выше 95%. </li><li> Извлечение липидов с помощью широкого sonicatиона в четыре раза в течение 1-2 часов каждый со смешанными растворителями полярности. Используйте 6 мл хлороформ-метанол 1:1 (объем / объем) в качестве первого и последнего растворителя. Шесть мл изопропанола: гексан: H 2 O 55:25:20 (V / V / V, снимите верхнюю фазу стремлением перед использованием) может быть использован в качестве второго и третьего растворителя. Этот растворитель получают путем смешивания изопропанол: гексан: H 2 O в соотношении 55:25:20, пожимая ее энергично, и позволяет верхней фазе появляются, которая будет удалена. Держите нижнюю фазу для использования. </li><li> Следите ультразвуком с центрифугирования для осаждения нерастворимого материала. Бассейн супернатантах. Высушите их в Speedvac в течение 4 часов. Поток азота или роторного испарителя может использоваться, если Speedvac недоступен. Используйте хороший холодной ловушки провести выпаривают органических растворителей. Загрязнение органического растворителя в вакууме масляного насоса приведет к ухудшению эффективности работы вакуумного насоса. </li><li> Выполните предварительный анализ с использованием высокой производительности тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ). Для количественной оценки гликолипидов, Подготовиться 0,2% орцинола в 50% раствор серной кислоты (100 мг в 50 мл) и галактоза стандартные (40 мг в 100 мл раствора). Подготовка в 30 мкл реакционного объема серию разведений для использования в качестве стандартной кривой (от 0 г / л до 20 г / л). Добавить 20 мкл метанола для каждого разведения образца серии. Растворите каждый гликолипид образца в 200 мкл метанола, разрушать ультразвуком, а также использовать 20 мкл для измерения количества гликолипидов. В 1,5 мл пробирок Эппендорф с резьбовыми крышками (Sarstedt, 72.692.005), добавить 0,4 мл 0,2% орцинола в 50% раствор серной кислоты в каждом образце, с серией Галактоза-H 2 O-метанол решения, которые служат для стандартной кривой . Кипятить в течение 5 мин в нагревательный блок при температуре 100 ° C. Читайте оптической плотности цветной реакции при 440 нм с использованием Восход Tecan Считыватель микропланшетов. Для выполнения ВЭТСХ, использовать хлороформ: метанол: H 2 O 60:35:8 (об / об / об) в качестве растворителя для нейтральных липидов обрабатывают хлороформ-метанол 1:1 (объем / объем). Используйте изопропанол: гексан: H 2 O 55:25:20 (об / об / об)растворитель для кислот липидов (ганглиозиды). Изолированной нейтралью GSLs растворяют в 200 мл растворителя хлороформ: метанол 1:1 (объем / объем) и наносили на Merck силикагеле тонкие пластины хроматографии на Drummond Microcaps. Планшеты работают в растворитель хлороформ: метанол: H 2 O 60:35:8 (V / V / V) и сушат. Гликосфинголипиды были визуализированы с помощью орцинола-серной кислотой при 300 ° C. </li><li> Для того, чтобы выделить нейтральные липиды от кислых липидов, часть из нейтральных и кислых липидов анионообменной хроматографии на маленькой колонке DEAE Sephadex-25 [DEAE Sephadex A25 смолы могут быть получены путем замачивания Sephadex-25 смолы порошка в хлороформ: метанол: H 2 O 30:60:8 (V / V / V) в течение ночи. Аспирируйте супернатанта до смолой Sephadex A25 это все, что осталось. Добавить свежие хлороформ: метанол: H 2 O 30:60:8 (об / об / об), чтобы вымыть смолу. Повторите три раза для удаления отрицательно заряженных остатков смолы Sephadex A25]. </li><li> Растворяться, Разрушать ультразвуком (не более 10 мин), и ресуспендируют липидов, начиная с шага 2.1 в хлороформ: метанол: H 2 O 30:60:8 (V / V / V) при необходимости. </li><li> Подготовьте небольшую DEAE Sephadex A25 (Cl форма) столбца с помощью стекловаты и 9 &quot;пипетки Пастера. Упакуйте стекловаты так тщательно, что смола порошок не проходит через колонку. Добавить DEAE Sephadex A25 (Cl форма) смолы&quot; шея &quot;на 9&quot; пипетки Пастера, не давая колонке сухой. Убедитесь, что вы не видите смолы в элюента. Образцы растворяли в смеси хлороформ: метанол: H 2 O 30:60:8 (V / V / V) были распущены. Нейтральной фракции липидов потока через дробь. </li><li> Элюируйте кислой фракции липидов (привязан к смолы) с 8 мл ацетата натрия в метаноле. Высушите как нейтральной и кислой фракции, опреснения их путем диализа, высушить их, Speedvac и анализировать их ВЭТСХ. </li></ol> Кислая фракция содержит ганглиозиды, которые могут быть диализу на шаге 3 Реакция напрямую.Нейтральная фракция содержит не только нейтральные гликосфинголипиды, но и фосфолипидов (фосфатидилхолина и сфингомиелина), которые должны быть удалены реакции ацетилирования. По нашему опыту, метод диализа кассеты, является более эффективным и удобным, чем трубка диализа или обратная фаза C18 колоночной хроматографии. <ol start="9"><li> Следующим шагом является удаление фосфолипидов из нейтральных гликосфинголипиды путем ацетилирования и peracetylation реакции. Высушите DEAE Sephadex-25 сквозного фракции в Speedvac (при охлаждении) в течение 4 часов. После того, как образцы сухой, положите их обратно в Speedvac и сухой в течение еще 4 часа. Убедитесь, что эти образцы являются полностью сухими, как и любой остаточной воды будет препятствовать peracetylation реакции. </li><li> Peracetylate образцов с 1 мл пиридина и 0,5 мл уксусного ангидрида в темном месте при комнатной температуре или 37 ° C в течение ночи. Это количество ангидрида уксусной пиридина и собственно на срок додо 200 мкг гликосфинголипидов. Эта реакция может быть осуществлена ​​при 37 ° C, а GSLs имеют лучшую растворимость. </li><li> Высушите перацетилированной материала Speedvac в течение 3 часов, с добавлением 1 мл толуола 3x (coevaporation) для обеспечения полного испарения. Если образцы все еще не полностью сухое, Speedvac до полного высыхания. </li><li> Подготовка Florisil (Sigma-Aldrich) колонки (30-60 меш, 10 × 80 мм) в пипетку Пастера с стекловаты, используя Florisil бисера. Florisil бисера должны быть полностью высушены перед использованием, путем инкубации в 110 ° C духовке. Заполните бусины в пипетку Пастера до шеи, и равновесие в 1,2-дихлорэтан-гексан, 4:1 (объем / объем). </li></ol> Элюирования из колонки Florisil очень быстро. Быстрое волатильности растворителей может привести к колонке сушки. Таким образом, все смеси растворителей должны быть подготовлены перед запуском столбца, поскольку это не возможно, чтобы остановить колонки во время элюирования. <ol start="13"><li> Применить peracetylated образца в 1 мл 1,2-дихлорэтана-гексан, 4:1 (объем / объем) и промыть колонку с 6 мл тем же растворителем, а затем 10 мл 1,2-дихлорэтана. Элюировать нейтральной перацетилированной GSLs с 6 мл 1,2-дихлорэтана-ацетон 1:1 (объем / объем). Этот шаг снимает перацетилированной фосфолипидов из гликосфинголипиды, потому что перацетилированной гликосфинголипиды связываться с Florisil колонку, в то время как перацетилированной фосфолипидов нет. </li><li> Высушите фракций Speedvac в течение 2 часов и deacetylate с 2 мл 0,5 М метилата натрия [Sigma-Aldrich, 403067] в 2 мл метанола в течение 3 часов при комнатной температуре. </li><li> Нейтрализовать смеси с 3 мл метанольного уксусной кислоты [уксусная кислота / метанол 15/85 V / V], сухая Speedvac, опреснения путем диализа [Растворите сухие продукты в 3 мл воды, и ввести в слайд-A-анализатора Диализ кассеты, диализ против воды в течение 24 часов. Меняйте воду по крайней мере дважды]. Высушите диализованной GSLs (в водном растворе) по Speedvac, пока образцы полностью высохли. </li&gt; </ol> 3. Химическая модификация (Permethylation) гликосфинголипидов 13 <ol><li> Представьте GSLs (1-20 мкг) в стеклянную трубку с винтовой крышкой и тефлоновым вкладышем, а также добавить диметилсульфоксид (150 мкл) без использования специальных условий сушки или атмосфере инертного газа. </li><li> Подготовка порошкообразного гидроксида натрия (40-60 мг) из частиц гидроксида натрия путем измельчения их в химический раствор с пестиком. Убедитесь, что для хранения порошков в очень сухой среде и быть осторожными, чтобы сделать измельчение в химической капот, чтобы избегать вдыхания порошка. </li><li> Затем добавьте порошок гидроксида натрия в растворе образца с помощью шпателя. Добавить йодметан (80 мкл) с 100 мкл Halmilton шприц, [или 100 мкл VWR калиброванные пипетки связано с шприцом через резиновую трубку можно использовать], и встряхните смесь при комнатной температуре в течение 1 часа. </li><li> Quench метилирования реакцию с водой (2 мл). Извлечение permethylated продуктов 3 разаКроме того дихлорметан (2 мл) [гликолипидов в дихлорметане фазу, которая является нижней фазе, так верхней фазы могут быть перенесены на новую стеклянную трубку, и снова экстрагируют дихлорметаном]. </li><li> Промойте комбинированный дихлорметан извлекает 3 раза с 2 мл воды [верхнюю фазу, которая является воду, затем могут быть утилизированы]. После последней промывки, передавать образцы новой трубы, и вытереть их насухо Speedvac. </li><li> Образцы могут быть растворены в 100 до 200 мкл метанола для ESI-MS анализа. </li></ol> 4. MALDI-TOF анализа Permethylated Gycosphingolipids <ol><li> Выполните MALDI-TOF-MS и MALDI-TOF/TOF-MS/MS эксперименты на MALDI TOF-TOF масс-спектрометр (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Подготовка матрицы путем смешивания 50% объема 10 мг / мл диоксибензойной кислоты (DHB) в ацетонитриле и 50% объема 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФК) в воде. </li><li> Матрица DHB может быть выставлен на MALDI маленький круглый щитT (1 мкл), затем 1 мкл (содержащий 100 нг GSLs) местная образца растворяют в метаноле. Применить медленно и дайте ему высохнуть перед анализом. </li></ol> 5. Ion Trap MS Анализ Permethylated гликосфинголипиды <ol><li> Провести масс-спектрометрии на линейной ионной ловушки масс-спектрометр (КТЛ, ThermoScientific, San Jose, CA) с использованием nanoelectrospray источника, 0,30 мкл / мин расход при 230 ° C капиллярной температура в режиме положительных ионов с 30-50% энергии столкновения. Установить энергий столкновения, чтобы оставить минимальную остаточную обилие предшественника ионов. Обнаружение всех ионов, как натрий аддуктов. </li><li> Определить iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) в изобарном смесь Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) и iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) стандартов путем сравнения различных моделей MS 4 ионы продукт от sodiated молекулярных ионов через фрагмент гликана м / з 667 и терминал дисахарид 1 - ен ионных м / з 445 (т.е.X → 667 → 445 →, X означает, что молекулярный ион обнаружен в MS 1) чистой permethylated iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) стандартов с помощью ESI-ЛИТ-MS с теми permethylated Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

<ol>
	<li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+Glycosphingolipids.">Chapter 10 Glycosphingolipids.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Bendelac, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17+NKT+cells+and+other+Innate-like+T+and+B+lineages.">Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages.</a> Fundamental Immunology. , (2011).</li><li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+shigella+diarrhea.+XI.+Isolation+of+a+shigella+toxin-binding+glycolipid+from+rabbit+jejunum+and+HeLa+cells+and+its+identification+as+globotriaosylceramide.">Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide.</a> J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).</li><li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+function+of+iGb3.">The immunological function of iGb3.</a> Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).</li><li>Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+glycolipid+prevents+autoimmune+encephalomyelitis+by+inducing+TH2+bias+of+natural+killer+T+cells.">A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells.</a> Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).</li><li>Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mapping+of+glycomes:+implications+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).</li><li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus.">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li><li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+quantitation+of+isoglobotriaosylceramide+in+the+presence+of+isobaric+components+using+electrospray+ionization-ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).</li><li>Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+isoglobo+and+globo+series+tetraglycosylceramides+in+human+thymus+by+ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).</li><li>Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+permethylation+of+glycolipid,+and+polysaccharide+catalyzed+by+methylsulfonyl+carbanion+in+dimethyl+sulfoxide.">A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide.</a> J. Biochem. (Tokyo). 55, 205 (1964).</li><li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simultaneous+methylation+of+fatty+and+hydroxy+fatty+acids+for+gas-liquid+chromatographic+analysis.">Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis.</a> Carbohydr. Res. 131, 209 (1984).</li><li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li><li>Levery, S. B., Hakomori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+methylation+analysis+of+glycolipids+using+capillary+gas+chromatography-chemical+ionization+mass+fragmentography+with+selected+ion+monitoring.">Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring.</a> Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).</li><li>Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+polyfucosylated+lactosaminoglycan+from+human+granulocytes.">Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).</li><li>Ciucanu, I., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oxidative+degradation+during+the+per-O-methylation+of+carbohydrates.">Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 16213 (2003).</li><li>Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-butyldeoxygalactonojirimycin+inhibits+glycolipid+biosynthesis+but+does+not+affect+N-linked+oligosaccharide+processing.">N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.</a> J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).</li><li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47+Structural+Analysis+of+Glycans.">Chapter 47 Structural Analysis of Glycans.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib:+an+MSn+spectral+library.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li></ol>

DZ является консультантом Biotex, Хьюстон, штат Техас, и изобретатель, участвующих в патентов, связанных с технологиями, упомянутые в этой статье, выданные или в приложении.

Glycome, термин, введенный по аналогии с геномом и протеома, относится ко всем сахарида структур организма. Чтобы в полной мере понять многообразие функций гликозилирования требуют комплексного подхода, включая функциональные и структурные glycomics исследований. Оба осложняется не-управляемых с помощью шаблонов характер гликана биосинтеза, в результате сложность и многообразие структур гликанов, частое участие агликона структуры в модуляции гликана лиганд-рецепторных взаимодействий на молекулярном уровне, и функциональное значение низкого лигандов изобилия. Принято считать, что масс-спектрометрии (МС) является незаменимым методом для структурных исследований glycomics, особенно для идентификации и характеристике низкой лигандов изобилия. Для наблюдения гликанов или гликоконъюгатов в качестве молекулярных видов, мы часто используем высокую эффективность, низкую энергию ионизации метод, называемый ионизации электрораспылением (ESI). Для получения дополнительной Detбеспокоило характеристику структуры гликанов, она имеет важное значение для выбора отдельных видов молекул и сломать гликанов на более мелкие куски. Обычно это делается при столкновении вызванной диссоциации, которая включает в себя активацию гликанов через столкновение с молекул инертного газа. Увеличение энергии вызывает разрыва связей, и систематический анализ полученных фрагментов предоставляет информацию о молекулярной структуре гликана. Часто, &quot;подпись&quot; фрагменты могут быть созданы, которые являются диагностическими для конкретного гликана структурные особенности. Вместе с молекулярной массой, эти фрагменты могут иногда быть достаточным для идентификации гликаны, но в прошлом гораздо больше информации, было необходимо, чтобы полностью охарактеризовать их, особенно если структура романа. Эти методы включают сахара анализа состава, газовой хроматографии масс-спектрометрии анализа частично метилированные alditol ацетаты для анализа сцепления, а также конкретные пищеварения гликозидазой 17. 18-19, несколько раундов низкой фрагментации энергии, которая может быть эффективно осуществлены в ионной ловушки масс-спектрометр (IT-MS), значительно улучшает информации выходом из гликана масс-спектрального анализа . С четырех или пяти раундов фрагментации (которая не может быть сделано с другими документами MS), можно различить изомерные гликанов, которые содержат те же компоненты, сахар, расположенных в различных связей сахар, даже если они находятся вместе в смеси компонентов с теми же Молекулярная масса (изобары). Для этого анализа гликанов были производные, заменой всех свободных гидроксильных групп с использованием метильных групп permethylation. В то время как структурное назначение гликанов возможно без permethylation, permethylation повышает чувствительность 17. Levery и Чжоу, объединили все потенциальные преимущества IT-MS методологии, включая обнаружение изомерных STRUctures использования сигнатурных диагностических ионов, наблюдается только в MS 4 и MS 5 спектров для высокочувствительных идентификации и количественного определения гликосфинголипиды присутствует в виде нескольких изобарических смеси 7-9. В теории, мы можем быть в состоянии идентифицировать каждую существующую структуру гликолипидов, до предоставления стандартных гликолипиды, которые могут быть химически синтезированы. Важных шагов этого анализа являются скорость восстановления GSLs из биологических образцов. Обычно 80 мкг GSL могут быть восстановлены со 100 млн. опухолевых клеток, таких как RBL. Для создания достаточной молекулярных ионов для нескольких раундов фрагментации в ионной ловушки масс-спектрометры, по меньшей мере 10 микрограмм опухоли GSLs не требуется. Низкая доходность GSLs во время очистки приведет к низкой численности ионов, которые не могут быть подвергнуты дальнейшей фрагментации. Успех анализа зависит от количества GSLs, которые выздоровели. Как правило, конечная концентрацияentration из permethylated GSLs должна достигать 1 мг / мл, растворяют в метаноле, перед проанализированы на нано-электрораспылением источник. Предел для тщательного анализа MS п зависит от обилия конкретных ионов в MS 1 анкету. Типичный E 7 ионный изобилия, необходимую для тщательного анализа MS 5. Низкий выход GSLs во время очистки может быть вызвано потерей GSLs во время peracetylation шаг (который удаляет фосфолипидов), когда за ацетилированный GSLs должен быть привязан к Florisil колоночной хроматографии смолы, промывают, а затем элюировали. Чтобы обеспечить связывание за ацетилированный GSLs на силикагеле, образцы должны быть перегружены в два раза к колоночной хроматографии после прохождения через.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2 Dichloroethane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34872</td>
 <td>Carcinogenic </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>VMR</td>
 <td>JT9524-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic anhydride</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>45830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A18P-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C606-1 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE Sephadex A25 (Cl Form)</td>
 <td>GE Healthcare Biosciences</td>
 <td>AB 17&mdash;170-01 </td>
 <td>100 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane (anhydrous): </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>457116 </td>
 <td>100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichloroacetic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D54702 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis cassette </td>
 <td>Fischer(Pierce) </td>
 <td>66110 </td>
 <td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>20684 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl acetate </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>UN1173 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Florisil</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>46384 </td>
 <td>for packing chromatography column</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hexanes </td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0290-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodomethane </td>
 <td>Riedel de Haen, Germany</td>
 <td>03810 </td>
 <td>stabilized with silver foil Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol </td>
 <td>VWR/EMD</td>
 <td>MXO475-1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral glycosphingolipid Qualmix </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1505</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monosialganglioside mixture</td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1508</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disialoganglioside mixture </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1509</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lactosyl ceramide and sialosylderivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1511</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyridine: </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>270407 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide: </td>
 <td>BDH </td>
 <td>0292 </td>
 <td>500 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium methoxide </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>404367 </td>
 <td>0.5 M solution in methanol</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Toluene </td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>9351-03 </td>
 <td>4 L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Name of the equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber glass (glass wool)</td>
 <td>Corning Incorporated</td>
 <td>3950 </td>
 <td>Pyrex 9989 glass</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm glass tubes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-962-10B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calibrated pipettes (100 microlitter)</td>
 <td>VMR</td>
 <td>53432-921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-961-29 </td>
 <td>With screw caps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Caps for glass tubes</td>
 <td>Kimble</td>
 <td>40566C </td>
 <td>size/13-415 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Merck TLC plates</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 29, 301-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tank for TLC</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 12,619-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps </td>
 <td>Drummond scientific company</td>
 <td>1-000-0100 </td>
 <td>10 &mu;l, for loading of TLC samples</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sunrise Microplate Absorbance Reader</td>
 <td>Tecan</td>
 <td>A-5082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Whatman Chromatography Paper</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>05-716-3E</td>
 <td>18 cm x 34 cm For TLC Tank</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Orcinol ferric chloride spray reagent</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>O7875</td>
 <td>For detecting glycosphingolipids on TLC plates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Prevel Spray Unit</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 36,555-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sonicator</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>Legend RT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Speedvac</td>
 <td>Savant</td>
 <td>AS160 </td>
 <td>With chemical trap for organic solvants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF-TOF Mass spectrometer</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Proteomics 4700 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ion Trap Mass spectrometer</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>LTQ </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

Пример анализа MALDI MS из гликосфинголипиды от лейкемии крыс линии клеток RBL (антигенпрезентирующих тип клеток, который представляет гликосфинголипид антигенов NKT клеток) показано на рисунке 3. Ионы могут быть отнесены к конкретным гликосфинголипид структуры (рис. 3А). В RBL клетки, обработанные по NB-DGJ 16, препарат, который ингибирует синтез гликосфинголипид, значительное сокращение всех гликосфинголипиды наблюдалось (рис. 3В). Структурные изомеры не могут быть выделены. MS / MS мощности Applied Biosystems 4700 позволяет фрагментации ионов MS1 MS 2-фрагменты, позволяющие ограниченной структурной информации, которые будут созданы. Тем не менее, MS2 анализа часто не достаточно, чтобы различать олигосахарид изомеров. Ионно-Trap MS анализа гликосфинголипиды позволяет изучать изомеры, такие как iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) и Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer), которые могут существовать в виде trihexosylceramide ионы обнаружены в 3А. Чтобы обнаружить такие изомеры, стандартный iGb3 и Gb3 были проанализированы несколько раундов фрагментации, пока не было обнаружено различий (рис. 4а и 4б). В примере, представленные здесь (рис. 5С) iGb3 и Gb3 может подвергаться дискриминации по сравнению с стандартными iGb3 и Gb3. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Рисунок 1. Блок-схема процедуры гликосфинголипид добычи и химической модификации гликосфинголипиды (permethylation). Гликосфинголипиды были извлечены из клеток органическими растворителями. Для удаления не гликосфинголипиды, липиды могут быть перацетилированной и деацетилированного. Во-вторых, гликосфинголипиды были химически модифицированы permethylation реакции, что повышает чувствительность и специфичность MS detectioн. Наконец, гликосфинголипид профилей определяется с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии ионной ловушки и масс-спектрометрии. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Рисунок 2. Гликосфинголипид Количественное по орцинола Серная кислота метод: Количественное гликосфинголипиды использовании 0,2% орцинола в 50% растворе серной кислоты и глюкозы в стандартной кривой. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Рисунок 3. Glycosphingolipidomics клеток лейкемии крыс A. представитель MALDI масс-спектра;. Каждого иона представляет собой специфическую структуру гликосфинголипид, структурных изомеров не могут быть выделены B. NB-DGJ, препарат, который ингибирует синтез гликосфинголипид, с.ignificantly сводит все гликосфинголипиды производится в RBL клеток. <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Рисунок 4. Тандемной масс-спектрометрии изомеров гликосфинголипиды. А. Характеристика пути разложения для положительного режиме ионной ловушки масс-спектрометрии permethylated GSLs GB 3 Cer и IGB 3 Cer. Gb 3 и IGB 3, четко отделены от их образцы фрагментации. Различия в связи отражены в MS 4 продукта ионов в соответствии с изобарической м / з 445 прекурсоров. B. Представитель результаты, показывающие, iGB3 может быть измерена в смеси iGb3/Gb3 изомеров. Звезды указывают диагностических ионов для iGb3 только. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы</a>увеличить фигуру. <img alt="Рисунок 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Рисунок 5. Ионной ловушкой MS позволяет провести анализ изомеров гликосфинголипиды. А. Стандартные iGb3 и Gb3 показать разницу фрагментации профиль после 4 туров фрагментации в ионной ловушке спектрометра LTQ массы. B. Характеристика MS 4 профиля ионы, полученные из iGb3 или Gb3. C. Trihexosyleramides являются смесями iGb3 и Gb3 изомеры, которые могут быть идентифицированы по ионной ловушкой MS методом (рисунок на Dapeng Zhou). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">Нажмите, чтобы увеличить показатель</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens at JoVE.com

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Специфичным и чувствительным методом, чтобы разобраться в выражении профиль гликосфинголипид антигенов в органах иммунной системы и клеток описано. Метод использует масс-спектрометрии ионной ловушки позволяет поэтапно фрагментации молекулы гликосфинголипид для структурного анализа, по сравнению с химически синтезированными стандартам.

Масс-спектрометрического анализа гликосфинголипид Антигены

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Фермент связанных Immunospot анализ (ELISPOT): Количественная оценка Th-1 клеточного иммунного ответа против микробных антигенов

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Антигены охраняемых Функциональные эритроциты Мембрана прививки Компактный сверхразветвленных полиглицерины

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Разработка Антиген-ведомой колита моделью для изучения Презентация антигенами путем антигенпрезентирующих клеток, Т-клеткам

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

С помощью рентгеновской кристаллографии, биофизики и функциональными пробами, чтобы определить механизмы управляющих Т-клеточного рецептора распознавания рака антигенам

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Очистка отсеке мембраны эндоплазматического ретикулума связаны деградации Экзогенные антигены в кросс презентация

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Выражение Экзогенные антигены в вакцины БЦЖ Mycobacterium bovis через Non генетические поверхности украшения с системой авидин биотин

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Роман фидер бесплатная система для массового производства мышиных естественных клеток-киллеров в пробирке

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Анализ одной ячейки иммунофенотип и производство цитокинов в периферической крови в целом через массовые цитометрии

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Споро адсорбция как Nonrecombinant отображения системы для ферментов и антигены

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

Идентификация нуклеолярных факторов во время репликации ВИЧ-1 через Rev Immunoprecipitation и масс-спектрометрию

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...