Name: mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens at JoVE.com

DZ stöds av MD Anderson Cancer Center och NIH bidrag AI079232. MD Anderson Cancer Center stöds delvis av NIH bidrag CA16672.

1. Lab Säkerhets Betänkande <ol><li> Alla organiska lösningsmedel skall förvaras i särskilda områden med tydlig märkning. Se etiketter på tillverkar för olika typer av brand krävs brandsläckare. </li><li> Flera reagenser är potentiellt cancerframkallande och kan orsaka depression. Dessa reagenser måste hanteras i en kemisk huva med ventilation (se tabell över specifika reagenser och utrustning för specifika). </li><li> Det rekommenderas att när man arbetar med organiska lösningsmedel och celler, personlig skyddsutrustning såsom handskar, skyddsrock och skyddsglasögon utnyttjas vid alla tidpunkter. </li></ol> 2. Extraktion av glykosfingolipider från celler Rat Leukemi <ol><li> Förvara RBL råtta leukemiceller 8 (10.000.000 till 100.000.000) i 16x100 mm glasrör i -80 ° C förhållanden. Cellerna räknas av en hemocytometer efter trypanblått-färgning. Viabiliteten av celler bör vara högre än 95%. </li><li> Extrahera lipider med omfattande sonication fyra gånger under 1-2 timmar vardera med blandade polaritet lösningsmedel. Användning 6 ml kloroform-metanol 1:1 (volym / volym) som den första och sista lösningsmedel. Sex milliliter isopropanol: hexan: H 2 O 55:25:20 (vol / vol / vol, avlägsna den övre fasen genom aspiration före användning) kan sedan användas som det andra och tredje lösningsmedel. Detta lösningsmedel framställs genom blandning av isopropanol: hexan: H 2 O i en 55:25:20 förhållande under kraftiga skakningar, och låta en övre fas visas, som kommer att tas bort. Håll den undre fasen för användning. </li><li> Följ sonikering med centrifugering för att pelletera det olösliga materialet. Pool supernatanterna. Torka dem i en Speedvac under 4 timmar. Kväveström eller rotationsindunstare kan användas om Speedvac är tillgänglig. Använd en bra kall fälla för att hålla förångade organiska lösningsmedel. Kontaminering av organiskt lösningsmedel i vakuumpump olja försämrar effektiviteten av vakuumpumpen. </li><li> Genomföra en preliminär analys med hög prestanda tunnskiktskromatografi (HPTLC). För att kvantifiera glykolipider, Framställa en 0,2% orcinol i 50% svavelsyra (100 mg i 50 ml) och en galaktos standard (40 mg i 100 ml stamlösning). Förbered i 30 pl reaktionsvolym en serie utspädningar för att använda som standard kurva (från 0 g / L till 20 g / L). Tillsätt 20 | il metanol till varje spädningsserie prov. Lös varje glykolipid prov i 200 | il metanol, sonikera och använda 20 pl för glykolipid kvantitet mätning. I 1,5 ml Eppendorf-rör med skruvade lock (Sarstedt, 72.692.005), tillsätt 0,4 ml 0,2% orcinol i 50% svavelsyra till varje prov, med en serie av galaktos-H 2 O-metanol lösningar som tjänar för standardkurva . Koka under 5 min i värmeblock vid 100 ° C. Läs optisk densitet av färgreaktionen vid 440 nm med Sunrise Tecan mikroplattläsare. För att utföra HPTLC, använd kloroform: metanol: H 2 O 60:35:8 (vol / vol / vol) som lösningsmedel för de neutrala lipiderna behandlades med kloroform-metanol 1:1 (volym / volym). Använd isopropanol: hexan: H 2 O 55:25:20 (vol / vol / vol) somlösningsmedlet för de sura lipiderna (gangliosider). De isolerade neutrala GSLs löstes i 200 pl lösningsmedel kloroform: metanol 1:1 (volym / volym) och laddades på Merck kiselgel tunnskiktskromatografiplatta av Drummond Microcaps. Plattorna kördes i lösningsmedel kloroform: metanol: H 2 O 60:35:8 (vol / vol / vol) och torkades. Glykosfingolipiderna visualiserades genom orcinol-svavelsyra vid 300 ° C. </li><li> För att separera ut de neutrala lipiderna från de sura lipiderna, fraktion ut de neutrala och sura lipider genom anjonbyteskromatografi på en liten kolonn av DEAE Sephadex A-25 [DEAE Sephadex A25 harts kan framställas genom att blötlägga Sephadex A-25-harts pulver i kloroform: metanol: H 2 O 30:60:8 (vol / vol / vol) över natt. Aspirera supernatanten tills Sephadex A25 hartset allt som finns kvar. Lägg färsk kloroform: metanol: H 2 O 30:60:8 (vol / vol / vol) för att tvätta hartset. Upprepa tre gånger för att avlägsna negativt laddade rester från Sephadex A25 harts]. </li><li> Lös, Sonikat (för mer än 10 min) och återsuspendera lipider från steg 2,1 i kloroform: metanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) när det behövs. </li><li> Förbered en liten DEAE-Sephadex A25 (Cl form) kolonn med användning av glasull och en 9 &quot;pastörpipett. Packa glasullen noggrant så att hartspulvret inte passerar genom kolonnen. Lägg DEAE Sephadex A25 (Cl-form) harts till&quot; hals &quot;av 9&quot; Pasteurpipett utan att låta kolonnen torka. Se till att du inte ser någon harts i eluent. Proverna lösta i kloroform: metanol: H 2 O 30:60:8 (vol / vol / vol) löstes. Den neutrala lipidfraktionen är flödet genom fraktionen. </li><li> Eluera den sura lipidfraktionen (bunden till hartserna) med 8 ml natriumacetat i metanol. Torka både neutrala och sura fraktioner, avsalta dem genom dialys, torka dem med Speedvac och analysera dem HPTLC. </li></ol> Den sura fraktionen innehåller gangliosider, som kan dialyseras för Steg 3 reaktionen direkt.Den neutrala fraktionen innehåller inte bara neutrala glykosfingolipider, men även fosfolipider (fosfatidylkolin och sfingomyelin), som måste avlägsnas med en acetyleringsreaktion. I vår erfarenhet, metoden för en dialys kassett, är effektivare och bekvämare än ett dialysrör eller omvänd fas C18 kolonnkromatografi. <ol start="9"><li> Nästa steg är att avlägsna fosfolipider från neutrala glykosfingolipider med en acetylering och peracetylation reaktion. Torka DEAE Sephadex A-25 genomslaget fraktion i Speedvac (med kylning) under 4 timmar. Efter att proverna är torra, lägg dem tillbaka i Speedvac och torka i ytterligare 4 timmar. Se till att dessa prover är helt torra, eftersom eventuellt restvatten kommer att förhindra peracetylation reaktionen. </li><li> Peracetylate proverna med 1 ml pyridin och 0,5 ml ättiksyraanhydrid i mörker vid rumstemperatur eller 37 ° C över natten. Denna mängd av pyridin och ättiksyraanhydrid är lämplig för upptill 200 pg av glykosfingolipider. Denna reaktion kan utföras vid 37 ° C, eftersom de GSLs har bättre löslighet. </li><li> Torka den peracetylerade materialet genom Speedvac under 3 timmar, med tillsats av 1 ml toluen 3x (samindunstning) för att säkerställa fullständig förångning. Om proverna är ännu inte helt torr, Speedvac tills den är torr. </li><li> Förbered en Florisil (Sigma-Aldrich) kolonn (30-60 mesh, 10 x 80 mm) i en Pasteur-pipett med glasull, med Florisil pärlor. Florisil pärlor bör helt torkas före användning, genom inkubation i en 110 ° C ugn. Fyll pärlorna i Pasteurpipett upp till halsen, och jämvikta i 1,2-dikloretan-hexan 4:1 (vol / vol). </li></ol> Eluering från kolonnen Florisil är mycket snabb. Snabb volatilitet av lösningsmedlen kan leda till kolumn torkning. Sålunda alla lösningsmedelsblandningar bör beredas innan kör kolonnen eftersom det inte är möjligt att stoppa kolonnen under elueringen. <ol start="13"><li> Applicera peracetylated prov i 1 ml 1,2-dikloretan-hexan 4:1 (vol / vol), och tvätta kolonnen med 6 ml av samma lösningsmedel, följt av 10 ml 1,2-dikloretan. Eluera neutrala peracetylerade GSLs med 6 ml 1,2-dikloretan-aceton 1:1 (volym / volym). Detta steg avlägsnar de peracetylerade fosfolipider från glykosfingolipider, eftersom de peracetylerade glykosfingolipiderna binder till Florisil kolonnen, medan peracetylerade fosfolipider inte. </li><li> Torka fraktionerna genom Speedvac under 2 timmar och deacetylate med 2 ml 0,5 M natriummetoxid [Sigma-Aldrich, 403.067] i 2 ml metanol under 3 timmar vid rumstemperatur. </li><li> Neutralisera blandningen med 3 ml metanol ättiksyra [ättiksyra / metanol 15/85 v / v] torr genom Speedvac, AVSALTA genom dialys [Lös torkade produkter i 3 ml vatten, och injicera i Slide-A-Lyzer Dialys Kassett, dialysera mot vatten under 24 timmar. Byt vatten minst två gånger]. Torka dialyserade GSLs (i vattenlösning) av Speedvac tills proverna är helt torra. </li&gt; </ol> 3. Kemisk modifiering (permetylering) av glykosfingolipider 13 <ol><li> Införa GSLs (1-20 pg) till ett glasrör med skruvlock och Teflon liner och tillsätt dimetylsulfoxid (150 pl) utan att använda speciella torkningsbetingelser eller inert gasatmosfär. </li><li> Förbered pulverformig natriumhydroxid (40-60 mg) från partiklar natriumhydroxid genom målning dem i en kemisk mortel med en mortelstöt. Se till att lagra pulver i en mycket torr miljö och vara noga med att göra målningen i den kemiska huven för att undvika att andas pulvren. </li><li> Nästa tillsätt pulvret natriumhydroxid till provlösningen med en spatel. Lägg jodmetan (80 | il) med en 100 mikroliter Halmilton spruta, [eller en 100 mikroliter VWR kalibrerad pipett kopplad till en spruta genom gummislang kan användas], och skaka blandningen vid rumstemperatur under 1 timme. </li><li> Släck metyleringsreaktionen med vatten (2 ml). Extrahera permetylerad produkter 3 gånger avtillsats av diklormetan (2 ml) [glykolipider är i diklormetan fasen, som är den undre fasen, så den övre fasen kan överföras till en ny glasrör, och extraherades åter med diklormetan]. </li><li> Tvätta kombinerade diklormetanextrakten 3 gånger med 2 ml vatten [den övre fasen, som är vatten, kan därefter kasseras]. Efter den sista tvätten, överföra prover till ett nytt rör och torka med Speedvac. </li><li> Prover kan sedan lösas upp i 100 till 200 pl metanol för ESI-MS-analys. </li></ol> 4. MALDI-TOF-analys av de permetylerade Gycosphingolipids <ol><li> Utför MALDI-TOF-MS och MALDI-TOF/TOF-MS/MS experiment på en MALDI TOF-TOF Mäss Spectrometer (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Förbered matrisen genom att blanda 50% volym av 10 mg / ml dihydroxibensoesyra (DHB) i acetonitril och 50% volym av 0,1% trifluorättiksyra (TFA) i vatten. </li><li> DHB Matrisen kan upptäckas på MALDI Target (1 pl), följt av en 1 ^ (innehållande 100 ng GSLs) fläck av provet upplöst i metanol. Applicera långsamt och låt den torka innan analys. </li></ol> 5. Jonfälla MS-analys av permetylerad glykosfingolipider <ol><li> Utför masspektrometri på en linjär jonfälla masspektrometer (LTQ, ThermoScientific, San José, CA) med användning av en källa nanoelectrospray, 0,30 pl / min flödeshastighet vid 230 ° C kapillär temperatur i positivt jonläge med 30-50% kollisionsenergi. Ställ kollisionsenergier att lämna en minimal kvarvarande överflöd av föregångare jon. Detektera alla joner som natrium addukter. </li><li> Identifiera iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) i en isobar blandning av Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) och iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) normer genom att jämföra olika mönster av MS 4 produkter joner från sodiated molekyljonen via glykan fragmentet m / z 667 och terminalen disackarid 1 - ene jon m / z 445 (dvs.X → 667 → 445 →, X betyder molekyljonen detekteras vid MS 1) av rena permetylerad iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) standarder via ESI-LIT-MS med de permetylerad Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

<ol>
	<li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+Glycosphingolipids.">Chapter 10 Glycosphingolipids.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Bendelac, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17+NKT+cells+and+other+Innate-like+T+and+B+lineages.">Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages.</a> Fundamental Immunology. , (2011).</li><li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+shigella+diarrhea.+XI.+Isolation+of+a+shigella+toxin-binding+glycolipid+from+rabbit+jejunum+and+HeLa+cells+and+its+identification+as+globotriaosylceramide.">Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide.</a> J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).</li><li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+function+of+iGb3.">The immunological function of iGb3.</a> Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).</li><li>Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+glycolipid+prevents+autoimmune+encephalomyelitis+by+inducing+TH2+bias+of+natural+killer+T+cells.">A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells.</a> Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).</li><li>Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mapping+of+glycomes:+implications+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).</li><li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus.">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li><li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+quantitation+of+isoglobotriaosylceramide+in+the+presence+of+isobaric+components+using+electrospray+ionization-ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).</li><li>Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+isoglobo+and+globo+series+tetraglycosylceramides+in+human+thymus+by+ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).</li><li>Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+permethylation+of+glycolipid,+and+polysaccharide+catalyzed+by+methylsulfonyl+carbanion+in+dimethyl+sulfoxide.">A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide.</a> J. Biochem. (Tokyo). 55, 205 (1964).</li><li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simultaneous+methylation+of+fatty+and+hydroxy+fatty+acids+for+gas-liquid+chromatographic+analysis.">Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis.</a> Carbohydr. Res. 131, 209 (1984).</li><li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li><li>Levery, S. B., Hakomori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+methylation+analysis+of+glycolipids+using+capillary+gas+chromatography-chemical+ionization+mass+fragmentography+with+selected+ion+monitoring.">Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring.</a> Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).</li><li>Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+polyfucosylated+lactosaminoglycan+from+human+granulocytes.">Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).</li><li>Ciucanu, I., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oxidative+degradation+during+the+per-O-methylation+of+carbohydrates.">Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 16213 (2003).</li><li>Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-butyldeoxygalactonojirimycin+inhibits+glycolipid+biosynthesis+but+does+not+affect+N-linked+oligosaccharide+processing.">N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.</a> J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).</li><li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47+Structural+Analysis+of+Glycans.">Chapter 47 Structural Analysis of Glycans.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib:+an+MSn+spectral+library.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li></ol>

DZ är konsult för BioTex, Houston, TX, och en uppfinnare som deltar i patent relaterade till teknik som nämns i denna artikel utfärdas, eller i ansökan.

Den glycome, en term som myntades i analogi med genomet och proteome, avser alla sackaridstrukturer hos en organism. För att till fullo förstå de många funktionerna i glykosylering kräver en integrerad strategi med både funktionella och strukturella glycomics studier. Båda kompliceras av den icke-mallbaserade natur glykan biosyntes, den resulterande komplexitet och mångfald glykanstrukturer, ofta flera aglykon struktur i modulera glykan ligand-receptor interaktioner på molekylär nivå och den funktionella betydelsen av låg förekomst ligander. Det är allmänt accepterat att masspektrometri (MS) är en oumbärlig metod för strukturella glycomics studier, särskilt för att identifiera och karakterisera låg förekomst ligander. För att observera glykaner eller glycoconjugates som molekyler, använder vi ofta en mycket effektiv, låg metod energi jonisering, kallad elektrospray (ESI). För mer DETailed karakterisering av glykan struktur är det viktigt att välja enskilda molekyler och bryta glykaner i mindre bitar. Detta sker normalt genom kollision-dissociation, vilket innebär aktivering glykanema genom kollision med inerta gasmolekyler. Den ökade energin inducerar obligationer brott och systematisk analys av de resulterande fragmenten ger information om den molekylära strukturen av glykan. Ofta kan &quot;signatur&quot; fragment genereras som är diagnostiska för särskilda glykan strukturella drag. Tillsammans med den molekylära massan, kan dessa fragment vara ibland tillräckligt för att identifiera glykaner, men i det förflutna mycket mer information har krävs för att fullständigt karakterisera dem, särskilt om strukturen är ny. Dessa metoder omfattar analys socker sammansättning, gaskromatografi masspektrometri analys av delvis metylerade alditol acetater för kopplingsanalys och specifik glykosidas matsmältningen 17. 18-19, flera omgångar av låg energi fragmentering, som effektivt kan genomföras i en jon-fälla masspektrometer (IT-MS), avsevärt förbättrar informationen avkastningen från glykan masspektralanalys . Med fyra eller fem omgångar av fragmentering (vilket inte kan göras med andra MS instrument), är det möjligt att skilja isomera glykaner som innehåller samma sockerkomponenter anordnade i olika sockerbindningar, även när dessa är närvarande tillsammans i blandningar av komponenter med samma molekylmassa (isobarerna). För denna analys var glykaner derivatiserade, som ersätter alla fria hydroxylgrupper med metylgrupper med permetylering. Även strukturella tilldelning av glykaner är möjlig utan permetylering ökar permetylering känsligheten 17. Levery och Zhou, har kombinerat alla de potentiella fördelarna med IT-MS metoden, inklusive detektering av isomera structures använder signatur diagnostiska joner, observerbara endast i MS 4 och MS 5 spektra, för mycket känsliga identifiering och kvantifiering av glykosfingolipider föreligger i form av flera isobariska blandningar 7-9. I teorin kan vi kan identifiera varje befintlig glykolipid struktur avvaktan på vanliga glykolipider, som kan syntetiseras kemiskt. De kritiska steg i denna analys är återvinningsgraden av GSLs från biologiska prover. Normalt 80 pg GSL kan återvinnas från 100 miljoner tumörceller som RBL. Att generera tillräckliga molekylära joner för flera omgångar av fragmentering i jon-fälla masspektrometrar är minst 10 mikrogram tumör GSLs krävs. Lågt utbyte av GSLs under rening kommer att leda till låg förekomst av joner, som inte kunde utsättas för ytterligare fragmentering. Framgången för analysen är beroende på mängden GSLs som återvinns. Typiskt, slutlig koncentration av permetylerad GSLs bör nå 1 mg / ml, löst i metanol, innan de analyseras på en nano-elektrospray källa. Gränsen för en grundlig MS-N-analys är beroende av förekomsten av specifika joner i MS 1 profil. En typisk e 7 jon överflöd krävs för en grundlig MS 5 analys. Det låga utbytet av GSLs under rening kan orsakas av förlust av GSLs under peracetylation steg (som avlägsnar fosfolipiderna), när de per-acetylerade GSLs måste vara bunden till Florisil harts kromatografikolonn, tvättades, och därefter eluerades. För att säkerställa bindningen av per-acetylerade GSLs silikagel, bör prover laddas två gånger till kromatografikolonnen efter att ha strömmat igenom.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2 Dichloroethane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34872</td>
 <td>Carcinogenic </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>VMR</td>
 <td>JT9524-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic anhydride</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>45830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A18P-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C606-1 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE Sephadex A25 (Cl Form)</td>
 <td>GE Healthcare Biosciences</td>
 <td>AB 17&mdash;170-01 </td>
 <td>100 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane (anhydrous): </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>457116 </td>
 <td>100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichloroacetic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D54702 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis cassette </td>
 <td>Fischer(Pierce) </td>
 <td>66110 </td>
 <td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>20684 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl acetate </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>UN1173 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Florisil</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>46384 </td>
 <td>for packing chromatography column</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hexanes </td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0290-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodomethane </td>
 <td>Riedel de Haen, Germany</td>
 <td>03810 </td>
 <td>stabilized with silver foil Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol </td>
 <td>VWR/EMD</td>
 <td>MXO475-1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral glycosphingolipid Qualmix </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1505</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monosialganglioside mixture</td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1508</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disialoganglioside mixture </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1509</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lactosyl ceramide and sialosylderivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1511</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyridine: </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>270407 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide: </td>
 <td>BDH </td>
 <td>0292 </td>
 <td>500 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium methoxide </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>404367 </td>
 <td>0.5 M solution in methanol</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Toluene </td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>9351-03 </td>
 <td>4 L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Name of the equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber glass (glass wool)</td>
 <td>Corning Incorporated</td>
 <td>3950 </td>
 <td>Pyrex 9989 glass</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm glass tubes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-962-10B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calibrated pipettes (100 microlitter)</td>
 <td>VMR</td>
 <td>53432-921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-961-29 </td>
 <td>With screw caps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Caps for glass tubes</td>
 <td>Kimble</td>
 <td>40566C </td>
 <td>size/13-415 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Merck TLC plates</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 29, 301-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tank for TLC</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 12,619-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps </td>
 <td>Drummond scientific company</td>
 <td>1-000-0100 </td>
 <td>10 &mu;l, for loading of TLC samples</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sunrise Microplate Absorbance Reader</td>
 <td>Tecan</td>
 <td>A-5082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Whatman Chromatography Paper</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>05-716-3E</td>
 <td>18 cm x 34 cm For TLC Tank</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Orcinol ferric chloride spray reagent</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>O7875</td>
 <td>For detecting glycosphingolipids on TLC plates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Prevel Spray Unit</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 36,555-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sonicator</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>Legend RT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Speedvac</td>
 <td>Savant</td>
 <td>AS160 </td>
 <td>With chemical trap for organic solvants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF-TOF Mass spectrometer</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Proteomics 4700 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ion Trap Mass spectrometer</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>LTQ </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens

Glykosfingolipider (GSL s) hör till glykokonjugat klassen biomakromolekyler, som bär strukturell information för betydande biologiska processer såsom embryonal utveckling, signaltransduktion, och immunförsvaret receptorigenkänning 1-2. De innehåller komplexa sockergrupper i form av isomerer, och enheter lipid med variationer inklusive fettacyl kedjelängd, omättnad, och hydroxylering. Både kolhydrat och ceramid delar kan vara grunden för biologisk betydelse. Till exempel tri-hexosylceramides inkluderar globotriaosylceramid (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) och isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), som har samma molekylmassor men distinkta kopplingar socker av kolhydratdel, ansvarig för helt andra biologiska funktioner 3-4. I ett annat exempel, har det visats att modifiering av ceramid delen av alfa-galaktosylceramid, en potent agonist ligand för invarimyra NKT celler, förändringar deras profiler cytokinutsöndring och funktion i djurmodeller av cancer och autoimmuna sjukdomar 5. Svårigheten att utföra en strukturell analys av isomerer i immun organ och celler tjänar som en barriär för att bestämma många biologiska funktioner 6. Här presenterar vi en visualiserad version av en metod för att relativt enkelt, snabbt och känslig analys av glykosfingolipid profiler i immunceller 7-9. Denna metod är baserad på extraktion och kemisk modifiering (permetylering, se nedan figur 5A, alla OH-grupper av hexos ersätts av MeO efter permetylering reaktion) av glykosfingolipider 10-15, följt av efterföljande analys med användning av matris-assisterad laserdesorptions / joniserings tid- of-flight masspektrometri (MALDI-TOF/MS) och jonfälla masspektrometri. Denna metod kräver 50 miljoner immunceller för en komplett analys. Försöken kan genomföras inom en vecka. Den relativa förekomsten av de olika glykosfingolipiderna kan avgränsas genom jämförelse med syntetiska standarder. Denna metod har en känslighet för att mäta 1% iGb3 bland Gb3 isomerer, när 2 fmol totalt iGb3/Gb3 blandning är närvarande 9. Jonfälla masspektrometri kan användas för att analysera isomerer. Till exempel, för att analysera förekomsten av globotriaosylceramid och isoglobtriaosylceramide i samma prov, kan man använda fragmentering av glykosfingolipid molekyler för att strukturellt skilja mellan de två (se nedan figur 5). Dessutom förbättras kemisk modifiering av sockerdelar (genom en permetylering reaktion) jonisering och effektivitet fragmentering för högre känslighet och specificitet, och ökar stabiliteten hos sialinsyrarester. Extraktionen och kemisk modifiering av glykosfingolipider kan utföras i en klassisk certifierad dragskåp, och masspektrometri kan utföras genom kärnananläggningar med jonfälla MS instrument.

Ett exempel på en MALDI MS analys av glykosfingolipiderna från rått leukemicellinje RBL (en antigenpresenterande cell typ som presenterar glykosfingolipid antigener till NKT celler) visas i figur 3. Jonerna kan tilldelas specifika glykosfingolipid strukturer (Figur 3A). I RBL-celler som behandlats med NB-DGJ 16, ett läkemedel som inhiberar syntesen glykosfingolipid, signifikant minskning av alla glykosfingolipider observerades (figur 3B). Strukturisomerer kan inte särskiljas. MS / MS kapacitet Applied Biosystems 4700 tillåter fragmentering av MS1 joner till MS 2 fragment, vilket begränsade strukturell information som skall genereras. Dock är MS2 analys ofta inte tillräckligt för att diskriminera oligosackarid isomerer. Ion-Trap MS-analys av glykosfingolipider möjliggör studiet av isomerer, såsom iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) och Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) som kan existera som de trihexosylceramide joner detekterade i Figur 3A. Att upptäcka sådana isomerer, var standard iGb3 och Gb3 analyseras av flera omgångar av fragmentering, tills skillnader fanns (Figur 4A och 4B). I exemplet som presenteras här (figur 5C) skulle iGb3 och Gb3 särskiljas genom att jämföra med standard iGb3 och Gb3. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Figur 1. Flödesschema över glykosfingolipid extraktionsproceduren, och kemisk modifiering av glykosfingolipider (permetylering). Glykosfingolipider extraherades från cellerna genom organiska lösningsmedel. Att avlägsna icke-glykosfingolipider, kan lipider vara peracetylerades och deacetylerad. Det andra var glykosfingolipider kemiskt modifierat genom en permetylering reaktion, vilket förbättrar känsligheten och specificiteten av MS detection.. Slutligen var de glykosfingolipid profilerna bestämdes med användning av MALDI-TOF masspektrometri och jonfälla masspektrometri. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Figur 2. Glykosfingolipid Kvantifiering genom orcinol svavelsyrametoden: Kvantifiering av glykosfingolipider med en 0,2% orcinol i 50% svavelsyra och en glukos standardkurva. <img alt="Figur 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Figur 3. Glycosphingolipidomics av celler från råtta leukemi A. representant MALDI masspektrum,. Varje jon representerar en specifik glykosfingolipid struktur, kan strukturella isomerer inte skiljas B. NB-DGJ, ett läkemedel som hämmar syntesen glykosfingolipid, s..ignificantly minskar alla glykosfingolipider produceras i RBL-celler. <img alt="Figur 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Figur 4. Tandemmasspektrometri av isomerer av glykosfingolipider. A. Karakteristiska sönderdelningsprodukter vägar för positiv läge jonfälla masspektrometri av permetylerad GSLs Gb 3 CER och IGB 3 Cer. Gb 3 och IGB 3 är klart åtskilda av sin splittring mönster. Skillnaderna i bindning återspeglas i MS 4 produkt joner som överensstämmer med de isobariska m / z 445 prekursorer. B. Representativa resultat visar iGB3 kan mätas i en blandning av iGb3/Gb3 isomerer. Stjärnor anger diagnostiska joner för iGb3 bara. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att</a>visa större bild. <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Figur 5. Jonfälla MS tillåter analys av isomerer av glykosfingolipider. A. Standard iGb3 och Gb3 visar skillnad i fragmentering profil efter 4 rundor av fragmentering i en jonfälla LTQ masspektrometer. B. Karakteristiskt MS 4 profil av joner som härrör från iGb3 eller Gb3. C. Trihexosyleramides är blandningar av iGb3 och Gb3-isomerer som kan identifieras genom jonfälla MS-metod (figur från Dapeng Zhou). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se större bild</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens at JoVE.com

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

En specifik och känslig metod för att få insikt i uttrycket profil glykosfingolipid antigener i immunsystemet organ och celler beskrivs. Metoden drar fördel av jonfälla masspektrometri tillåter stegvis fragmentering av glykosfingolipid molekyler för strukturell analys i jämförelse med kemiskt syntetiserade standarderna.

Masspektrometrisk analys av glykosfingolipid antigener

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzymkopplad immunospot analys (ELISPOT): Kvantifiering av TH-1 cellulära immunsvaret mot mikrobiella antigener

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener skyddade funktionella röda blodkroppar av membranet Ympning av kompakt Hyperförgrenade Polyglyceroler

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Utveckling av ett antigen-driven kolit modell för att studera Presentation av antigener genom antigenpresenterande celler till T-celler

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Med användning av röntgenkristallografi, Biophysics, och Funktionella analyser för att bestämma de mekanismer som styr T-cellsreceptorigenkänning of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Rening av membran facket för endoplasmatiska nätverket-associerade nedbrytningen av exogena antigen i Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Uttryck av exogena antigen i Mycobacterium bovis BCG vaccinet via icke-genetiska yta dekoration med metoden-biotin systemet

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fria System för massproduktion av murina naturliga mördarceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Single-cell analys av Immunophenotype och cytokin produktion i perifera helblod via massa flödescytometri

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Spore Adsorption som en Nonrecombinant displaysystem för enzymer och antigener

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

Identifiering av nukleolära faktorer under HIV-1-replikation genom rev immunoprecipitation och masspektrometri

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...